planter og patogenet
den almindelige isplante (Mesembryanthemum crystallinum L.) blev dyrket i et drivhus som beskrevet af Kuristniak et al. . Efter udseendet af det 3.bladpar blev et sæt planter vandet med 0,4 M NaCl for at inducere Crassulacean syre metabolisme (CAM planter), mens en anden blev yderligere vandet med ledningsvand (C3 planter). Efter 12 dage blev induktionen af CAM i de NaCl – behandlede planter bekræftet ved at måle det daglige kurvemalat i bladcellesaften. Derefter blev blade af 2.bladpar af C3-og KAMPLANTER inokuleret med Botrytis cinerea ifølge ku Karrniak et al. .
Chlorophyll a fluorescensafbildning
Mini-versionen af en Imaging-PAM Chlorophyll Fluorometer M-serie (Vals, Effeltrich, Tyskland) udstyret med en bladholder blev brugt til at registrere fluorescensafbildning (Imaging-PAM M-serie Chlorophyll Fluorometer) . Fluorometeret er en bladklipsmodel til feltapplikationer. Bladholderen sikrer, at bladet holdes vandret i forhold til lyskilden for at undgå heterogen belysning over forskellige områder af bladprøven. Prøveudtagningspositionerne blev valgt til at være lige fordelt langs midterribben, men de var lidt forskellige for ethvert blad på grund af dets størrelse og morfologi og teknikken til at placere blade i holderen. For kun at identificere virkningerne af biotisk stress, og for at undgå introduktion af artefakter i klorofylfluorescensmålingsproceduren, ingen referencemærker, der tillader bladbilledreferencer, blev anvendt på bladene. Klorofylfluorescens fra almindelige isplanteblade blev opnået ved at definere interesseområde (Aoi-værktøj) ved hjælp af Imaging vinde 2.41 a-programmet.
med Imaging-PAM blev det nuværende fluorescensudbytte (Ft) kontinuerligt overvåget. Planter var mørke tilpasset i 20 minutter. Ved anvendelse af en mætningsimpuls blev fluorescensudbyttet på mørkt niveau (Ft = F0) og det maksimale fluorescensudbytte (Fm) bestemt. Det maksimale PSII-kvanteudbytte, Fv/Fm og kvanteudbyttet af reguleret og ikke-reguleret energiafledning i PSII, Y(NPK) og Y(Nej) blev afbildet. Fv / Fm blev beregnet i henhold til ligningen: Fv/Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPK) blev beregnet i henhold til Kramer et al. ved formlen: 1-Y (II) – 1/(NPK + 1 + fm (Fm / F0 − 1)). Y (Nej) blev beregnet i henhold til Kramer et al. ved ligningen: Y (Nej) = 1/. Billeddannelsesprocessen giver pseudo-farve (indekseret farvetilstand) billeder af biologisk materiale med en opløsning 640 liter 480 billedpunkter svarende til synsfeltet for de fysiske dimensioner 32 liter 24 mm.
de inficerede blade af C3-og CAM-planterne blev taget til CHL en fluorescensanalyse på tidspunktet for inokulation og 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 72 timer efter vaccination. Chl en fluorescens blev målt for vedhæftede blade af 2.bladpar fra tre C3-og KAMPLANTER, der kom fra to uafhængige gentagelser af plantedyrkning. Hvert blad taget til analyse blev separat screenet på alle tidspunkter (Fig. 1). Repræsentativ serie på ni billeder(et for hvert tidspunkt) af Y(NO), Y (NPK) og Fv/Fm for C3-og CAM-isanlæg er blevet behandlet for at måle ændringer af disse parametre i et udvalgt område af bladblad screenet over tid. Til sammenligning, y(nej), Y (NPK) og Fv/Fm gennemsnitsdata fra hele bladområderne afbildet i Fig. 2 blev opnået. Resultaterne af billedjustering og måling af den spatiotemporale pattering af biotisk spændingsudbredelse i blade med den foreslåede metode blev eksemplificeret på Y(Nej) billeder.
eksempel billeder af kvanteudbytte af ikke-reguleret energidissipation i almindelige isplanteblade. Gælder for PSII Y(NO) af C3 (a–d) og CAM (e–h) fluorescensparametre. Bladfragmentet indeholder stedet for patogeninokulation og symptomer på stressudbredelse
Eksempel billede af C3 fælles is plante blad med udvalgte regioner af interesse. Manuelt foretagne valg i editoren dækker de inficerede (1), symptomløse (2) såvel som midrib-områderne (3)
Billedjustering
mekanismen for Pam-billeddataindsamling i tidssekvens resulterer i bevægelse af bladfragmentet i synsfeltet mellem individuelle tidspunkter (Fig. 1). På grund af ændringen af bladpositionen har sådanne egenskaber som midrib og inokulationsstederne både forskellig placering og orientering. Desuden kan effekten af omskalering observeres. For korrekt vurdering af spændingsudbredelse skal visningsfelterne synkroniseres gensidigt under forudsætning af, at et af dem er et reference (fast) billede og resten af billeder, der skal justeres med det faste. Denne tilgang er kendt i medicinsk billeddannelse som billedregistrering . Den grundlæggende registreringsopgave for fluorescensbillederne er at finde ‘lighedstransformationen’ bestående af passende rotation, Oversættelse og skalering. Bladoverfladen bøjning og foldning af blade fra stress forekommer kun i lokale regioner af enkeltbilleder og er af mindre betydning for den globale billedjustering. De kan kompenseres på registreringsstadiet efter forarbejdning ved ikke-lineære transformationer som f .eks. tyndplade, overfladesplinser og dæmonkortlægninger.
fluorescensbillederne tages som en serie skud i foruddefinerede tidsintervaller på omtrent det samme bladområde. De karakteristiske elementer i den betragtede stak af billeder repræsenterer hovedsageligt bladårer. Men de er dårligt skelnes fra billedindholdet på grund af begrænset kontrast samt farve mode PAM imaging. Områderne med stresssymptomer, der visuelt dominerer indholdet, kan ændre sig mellem billeder i en enkelt serie. I en sådan situation ville automatisk registrering mislykkes.
de mest populære, automatiske avancerede metoder er baseret på sammenligning af billedintensitet med nogle korrelationsmålinger (intensitetsbaserede metoder) eller stole på at søge i de faste og bevægelige billeder for korrespondancen mellem valgte billedfunktioner såsom punkter, linjer og konturer (funktionsbaserede metoder) . Ingen af disse fremgangsmåder muliggør korrekt registrering af Pam-fluorescensbilleder af almindeligt isanlæg, hvad der er verificeret og vist i eksemplerne inkluderet i supplerende materialer (yderligere fil 1). De resultater, der præsenteres der, bekræfter, at årsagen til mislykkede automatiske registreringer er den stærke tilsløring af billedregioner med bevarede træk ved dynamiske ændringer i billedindholdet forårsaget af infektion i bladvævet. Test af de populære metoder blev udført både af Registreringsestimatoren i Matlab og i Fiji-miljøet .
algoritmen til Pam-billedregistrering blev designet i Matlab-miljø baseret på det sæt kontrolpunkter, der er valgt manuelt af en ekspert. For at indstille de tilsvarende kontrolpunkter i hvert billede blev funktionen cpselect af Kontrolpunktsvalgsværktøj fra Billedbehandlingsværktøjskasse anvendt. Billeder blev redigeret parvis inklusive et fast billede og et bevægeligt billede. Det første billede erhvervet lige efter patogeninokulation blev antaget som et fast (reference) billede. Gennem interaktiv punktkortlægning kan brugeren ikke kun pege på de synlige konturer af nerver, men også andre karakteristiske elementer, såsom injektionspunktet, steder langs patogenudbredelsen såvel som de mest tilsyneladende epidermale blæreceller (Fig. 3).
kontrolpunkter valgt af eksperten. Eksempel Y(Nej) billeder af et bladfragment af en CAM almindelig isplante: et fast (reference) billede, B bevægeligt billede, der skal justeres med det faste
flere par kontrolpunktplaceringer, fordelt så bredt som muligt over bladbilledoverfladen, er tilstrækkelige til korrekt at justere billederne af det samme blad, der groft betragtes som en stiv krop. Bredere fordeling af kontrolpunkter forbedrer følsomheden af billedtilpasning, men er begrænset af billedvisningsfeltet beskåret efter justeringstransformationen og af muligheden for præcis placering af det valgte punkt på bladbladet. Med en sådan billedjustering blev affine-transformationen udført ved hjælp af funktionen fitgeotrans inkluderet i Billedbehandlingsværktøjskasse. Denne transformation har været begrænset til’ lighed ‘ – versionen (kun bestående af oversættelse, rotation og lighed), fordi scenen i PAM-fluorometeret syntes at være ikke vippet. Bevægelige billeder blev matchet til det faste billede ved hjælp af funktionen imvarp. Grafisk illustration af registreringsalgoritmen er inkluderet i Fig. 4.
blokdiagrammet for Affin og valgfri B-spline-registrering anvendt på fluorescens Pam-billeder. \(\left\) – vektoren af kontrolpunkter i det faste billede, \(\left^{\left (k \ right)}\) – vektoren af kontrolpunkter i k – th bevægende billede, \(\left^{{\left ({k^{\prime } } \ right)}}\) – vektoren af kontrolpunkter i k-th bevægende billede efter B-spline registrering
blade på forskellige infektionsstadier kan have en overflade lokalt bølget eller rynket som i det område, der er markeret i analyserede PAM-fluorometerbilleder (Fig. 5a, b), hvilken form potentielt kan påvirke den korrekte analyse af patogenformeringsfænomenet. Det betyder, at affine-registreringsmetoden baseret på geometrisk transformation muligvis ikke er tilstrækkelig til at matche fluorescens Pam-billeder i nogle tilfælde af blade med tilsyneladende synlig ikke-lineær deformation. Derfor foreslår forfatterne en to-trins registreringsmetode, hvor Affin stiv registrering efterfølges af B-spline-registrering, der reducerer ikke-lineære deformationer.
eksempel på affine og B-spline registreringer for C3 fælles is plante blad billede. a y (NO) – billedet efter Pam-erhvervelse, B billedet efter stiv affintransformation med pilene, der repræsenterer interaktivt indstillede forskydningsvektorer anvendt i anden fase af registrering og C endelig form efter kontrolpunktsbaseret B-spline-registrering
valget af ikke-stiv registreringstype udnytter det faktum, at almindelige isplanteblade repræsenterer lidt fleksibelt materiale, og små bøjningskræfter holder glatte ændringer i en bladoverfladeprofil. Specificiteten af denne registreringsændring er, at vektorerne i billeddeformationsfeltet skal pålægges interaktivt. Til dette formål blev en dedikeret vektorfelteditor knyttet til algoritmen. Kun få forskydningsvektorer i det bevægelige billede skal specificeres for at registrere lokale og glatte deformationer af en bladoverflade som i Fig. 5b.
B-spline Rueckert-algoritmen blev valgt til anden fase af registreringen. Dens implementering er tilgængelig i Matlab Central filudveksling som Dirk-Jan Kroon Spline registrering værktøjskasse .
B-spline-registreringsproceduren består af to grundlæggende trin:
-
initialisering af et gitter G af billedpunkter jævnt fordelt over billedoverfladen med alle deformationsfeltvektorer indstillet til nul og derefter beregning af et tæt vektorfelt T af deformationer i gitteret G ved kubisk B-spline interpolation af manuelt indstillede kontrolpunktsforskydningsvektorer \(\left^{\left( k \right)}\). Både gitteret og det tilhørende transformationsfelt T raffineres derefter iterativt i 4 trin for at reducere Gittern node afstand. Transformationen T er udarbejdet af funktionen point_registrering fra Spline registrering værktøjskasse.
-
B-spline-transformation af alle billedpositioner og bi-kubiske interpolationer af farvekomponenter i det bevægende (affine-registrerede) billede \(I_{m}\) i henhold til spline-glattet deformationsfelt.
Billedregistreringsnøjagtighed
nøjagtigheden af den foreslåede billedjustering blev udført af rodmiddelkvadrat (RMS) på afvigelser på N = 15 kontrolpunkter vist i Fig. 3. Forskydningen af hvert fast billedkontrolpunkt \(P_{i}\) evalueret i et bevægeligt billede for sagen med og uden justeringen blev illustreret i Fig. 6 som vektorerne \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) og \(K_{i} P_{i} =\Delta k_{i}\) henholdsvis. RMS-forskydningsfejlene for alle kontrolpunkter i et enkelt billede for de to tilfælde er udtrykt i EKV. (1) som \(\Delta r_{\tekst{rms}}\) og \(\Delta k_{\tekst{rms}}\).
Illustration af fejlvurderingen i affine registrering af PAM-billeder. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrolpunkt i det faste billede \(I_{F}\), \(K_{i}\)—kortlægning af kontrolpunktet \(P_{i}\) i det bevægelige billede \(I_{M}\), \(R_{i}\)—kortlægning af kontrolpunktet \(P_{\tekst{i}}\) efter registrering, \(r_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—forskydningsfejl for kontrolpunktet \(p_{\tekst{i}}\) efter registrering
procentdelen af resterende forskydning \(\delta_{rms}\) efter affine type registrering kan evalueres pr. (2).
de evaluerede affine-registreringsfejl er anført i tabel 1. De oprindelige forskydninger\(\Delta k_ {\tekst{rms}}\), der varierer fra 3,01 til 7,09 mm, reduceres efter ‘lighedsregistreringen’ til området fra 0,45 til 1,71 mm\(\Delta r_ {\tekst{rms}}\) for det testede C3-anlæg. De samme parametre for CAM plant er \(1,90 \ div 5,69\; {\tekst{mm}}\) for \(\Delta k_{\tekst{rms}}\) og \(0,41 \div 1,53\;{\tekst{mm}}\) for \(\Delta r_{\tekst{rms}}\). Når \(\delta_{rms}\) er gennemsnitligt både for C3-og CAM-billedserier, svarer det til henholdsvis 21% og 23%. Værdierne for fluorescensparametre Y (NO), FV / Fm og NPK opnået fra billeder af isplanteblade uden registrering hentes fra uforenelige dele af bladet og kan ikke tages i betragtning (se yderligere fil 2).
for yderligere kortlægning af B-spline-registrering defineres transformationsfejlen af to komponenter. Den første af dem er postregistreringsforskydningen \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) vist i Fig. 7a, med \(r_{i}\) evalueret i Ek. (3) som centroid \(\bar{p}\) i regionen \(a_{i}\).
hvor \(I_{R} \left (p \right) \in \left\) angiver intensiteten af det registrerede kontrolpunktbillede ved billedpunktet p, \(\left| {a_{i} } \right|\)—det slørede område. Fejlen anden komponent er defineret af standardafvigelsen radius \(\rho_{i}\) af intensitet spredt omkring hvert kontrolpunkt \(R_{i}\) som beskrevet i Ek. (4).
hvor \(\left \| \cdot\ right\|\) angiver den euklidiske norm for vektoren mellem punkterne p og \(\bar{p}\) i billedplanet. Sløring af det justerede kontrolpunkt \(R_{i}\) vises på grund af det faktum, at den ikke-lineære registrering bruger bicubisk interpolation i det endelige opløsningsgitter G. denne effekt blev målt eksperimentelt ved at udføre en given B-spline-transformation i billedet bygget fra hvide kontrolpunkter på en sort baggrund. Tabel 2 inkluderer størrelserne \(\Delta k_{i}\) af N = 9 eksempel forskydning feltvektorer vist i Fig. 5b. Størrelserne \(\Delta r_{i}\) af vektorkortlægningsfejlene efter spline-registrering måles mellem de ønskede faste kontrolpunkter \(P_{i}\) og centroiderne for registrerede punkter \(R_{i}\) evalueret i regionen \(a_{i}\). Alle testede \(\Delta r_{i}\) værdier er under billedopløsningen lig med \(50\; \ upmu {\tekst{m}}\) og kan forsømmes—afrundet til 0. Dette betyder præcis positionering af kontrolpunkter ved spline-transformationen. Standardafvigelsen \(\rho_{i}\) for sløringsområdet vist i tabel 2 efter fordobling kan være et mål for sløring af kontrolpunkt. Derefter varierer det Ca. fra \(24\; {\tekst{til}}\; 63\; \ upmu {\tekst{m}}\) hvad svarer til en-billedsløring. Således tillader denne transformation lokalt at gendanne den korrekte form af Y(Nej) ændringer i et fluorescensbillede.
forklaring af fejlen i B-spline billedregistrering af PAM-billeder. a uoverensstemmelsen mellem kortlægning af kontrolpunktets placering under registrering, B billedintensitetsfordeling af spline-registreret kontrolpunkt, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrolpunkt i det faste billede \(I_{F}\), \(K_{i}\)—ækvivalenten af kontrolpunkt \(P_{i}\) i det bevægelige billede \(I_{M}\), \(R_{i}\)—kortlægning af kontrolpunktet \(P_{i}\) efter registrering, \(r_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—forskydningsfejl mål for kortlægning af kontrolpunktet \(p_{i}\), \(a_{i}\)—sløret område omkring \(R_{I}\) svarende til kontrolpunktet \(p_{i}\), \(\rho_{i}\)—Standardafvigelsesradius for \(R_{i}\) sløring
måling af spændingsudbredelse
dataanalysen anvender et specielt redigeringsværktøj til at manipulere en stak PAM-billeder efter deres registrering. Hovedredigeringsfunktionen gør det muligt at tegne to dataindsamlingslinjesektioner \(L_{1} \;{\tekst{og}}\;L_{2}\) af samme længde (Fig. 8), som kan observeres og fås på ethvert billede fra stakken. I det betragtede eksperiment starter den første linje \(L_{1}\) på inokulationsstedet \(s_{1}\), hvor stressfaktoren påføres bladvævet på tidspunktet t og skal være omtrent indstillet i retning af spændingsudvidelse. Den anden linje \(l_{2}\) placeres langs midterribben, hvor den observerede stresspåvirkning i tid altid var begrænset, og fluorescensparametre udviser minimale ændringer. Linjerne skal passe helt i billedets sammenhæng.
måleområder I Y (Nej) billeder af almindelige isplanteblade efter computerjusteringen. Målepunkterne angiver: (1) mesofyl på inokulationsstedet, (2) mesofyl uden skade, (3) midrib nær inokulationsstedet. Målelinjen (L1) er orienteret i retning af spændingsudbredelse inden for mesofyl, og linjen (L2) er placeret langs midrib. Linjer startet ved henholdsvis punkt (S1) og (S2)
yderligere mulighed for punktvis måling er mulig, hvor tre små forskellige cirkulære områder af 10-billedradiusen placeres interaktivt i synsfeltet (Fig. 8). De skal tilhøre bladområderne med forskellige fluorescensparameter, der patterer over tid. Alle registrerede billedværdier er gennemsnitlige i disse regioner.