resultater
Gastrulationsdefekter i Chrd-/- mus
Det Chrd-udskillede Bmp-bindende protein udtrykkes i musenoden ogdets derivater, notochord og pharyngeal endoderm(Fig. 1A-F). CR1 og CR3 viser den højeste affinitet for Bmp4 og kan modvirke BMP signalsupon mRNA injektion i Ksenopus embryoner(Larrain et al., 2000). Tilogenerere en nul allel af Chrd, vi forberedte en målretningskonstruktion med oversættelsestopkodoner i de tre mulige læserammer inden for signalpeptidregionen. Stopkodonerne blev efterfulgt af en frameshift og indsætning efter CR1 af IRES-lacs og PGK-neo-kassetter, der yderligere afbrød Chrd-genet (Fig.1G). Udskrifter fra denne Chrdtm1DR-allel(i det efterfølgende benævnt Chrd-) var ikke detekterbare inChrd-/- embryoner på knudepunktet (Fig. 1J, pilespids).
Heterosyge chrd-mus var levedygtige og frugtbare og blev parret tilogenerate Chrd – / – embryoner af forskellige udviklingsmæssige stages.At dag E8.5 observerede vi tilstedeværelsen af resorptionsknuder i livmoderen afgravide kvinder og en lille reduktion i det forventede antal chrd-/- embryoner (50 genvundet, 57 forventet). Fourgenotypede homosygøse mutante embryoner viste en klar reduktion i størrelsen af det embryonale område ledsaget af en udvidelse af allantois med respekt for resten af embryoet (Fig.2A, A’). I histologiske sektioner er en betydelig hypoplasiaf den neurale plade (Fig.2B, B’), fravær af somitter og notokord(Fig. 2C, C’) og en overflod af ekstra-embryonale mesodermale celler i allantois(Fig. 2D, D’) varobserveret. Resten af mutanterne (46) var morfologisk ikke skelnelige fra deres heterosygøse og vilde kuldkammerater. Fænotypen af fourabnormale mutanter svarede til, men mindre udtalt end ventraliseringen af mesoderm observeret i dobbelt homosygøs Chrd;Nogmutanter (Bachiller et al., 2000), hvor der desuden var forreste trunkeringer af neuralpladen også til stede.
Gastrulationsfænotype af Chrd-/- embryoner. A) vildtype-og (a’) mutante embryoner på et tidligt somitstadium. I mutanten reduceres kroppen, og allantois (al) forstørres proportionalt.(B-D’) sektioner gennem vildtype(B-D) og mutante embryoner (B’-D’) på de niveauer, der er angivet i A og a’. Bemærk den dårligt differentierede neurale plade (np) af mutanten (B’) og dens mangel påtrunk mesoderm (C’). (D’) stigningen i ekstraembryoniskmesodermale celler i mutantens allantois. så, somite.
i nogle tilfælde kan det være nødvendigt at foretage en inaktivering af Chrd, hvilket resulterer i en udvidelse af ventral mesoderm og reduktion af dorsal mesoderm og neuralplate (Schulte-Merker et al.,1997). I pattedyr dannes mesoderm under gastrulation vedingression af epiblastceller gennem den primitive stribe. Celler, der forlader den bageste ende af den primitive stribe, bevæger sig ind i den ekstra-embryonale region, hvor de giver anledning til en mesodermal afstamning (allantois, amnion og bloodislands of The yolk sac) svarende til den ventrale mesoderm ofksenopus. I modsætning hertil forbliver celler placeret i flere forreste områder afbrydning inde i embryoet korrekt og producerer paraksial, mellemprodukt og lateral plade mesoderm af den fremtidige bagagerum. Den tidlige fænotype afchrd – / – mutanter, hvor allantois udvides vedudgift af den embryonale mesoderm, er i overensstemmelse med en tidlig ventraliseringaf musembryoet. Denne fænotype skal føre til død af de berørte dyr, da ingen homosygøs mutant med unormal allantois blev genvundet fradissektioner på senere stadier. Analyse af denne fænotype med molekylære markørerblev ikke udført, fordi der blev opnået så få unormale embryoner.
Perinatal dødelighed
kun 49% (95 ud af 194) af de forventede Chrd-/-dyr blev genfundet ved fødslen, alle viste den samme fuldt penetrantphenotype. Af disse var flertallet dødfødt, men nogle få forsøgte uden held at puste deres lunger op. Eksternt homosygøse mutante neonatervar lidt mindre end deres vildtype kuldkammerater og viste cyanose,mikrocefali og reduktion af det ydre øre, som blev sat unormalt tættil øjet (Fig. 3A’).Histologisk undersøgelse (Fig.3B ‘- C’) afslørede manglen på thymus (t, et derivataf den tredje pharyngeal pose) og sekundær gane (p) og hypoplasi afindre øre (dvs.) i mutanterne. Den forreste lobe og pars intermedia afsituitær kirtel (pi), begge afledt af dorsal oral ectoderm straksstøder op til den cephaliske grænse af den forreste endoderm, var normale(Fig. 3C, C’). Dette definerede den rostrale grænse for fænotypen i oropharynks, med malformationer begrænset til derivater af Chrd-ekspressionsendoderm. Skjoldbruskkirtlen, der dannes i ventral pharyngeal endoderm vedforamen caecum, differentierede, men var hypoplastisk og af uregelmæssig form(TH, Fig. 3C’). Detparathyroidkirtler, derivater af pharyngeal poser 3 og 4, var fraværende(data ikke vist), en observation i overensstemmelse med neonatal hypokalcæmiset hos personer med DiGeorge syndrom(DiGeorge, 1968). Vi konkludererat fænotypen af Chrd – / – dødfødte mus rekapitulererde fleste af de funktioner, der er beskrevet i sådanne individer.
morfologisk og histologisk analyse af chrd-/-nyfødte mus. (A, A’) udseende af vildtype (A) og homosygmutant (a’) mus. Mutanterne virker cyanotiske; deres ydre øre erreduceret og sat tættere på øjet end i vildtype. (B,B’) Sagittalsektioner af vildtype (B) og mutant (B’) mus. I mutanten er densekundære gane (p) og thymus (t) fraværende, og laryngeal brusk(l) er stærkt reduceret i størrelse. Den overordnede morfologi og størrelse afcentralnervesystemet blev ikke påvirket. (C,C’) koronale sektioner af mus af vildtype (C) og mutant (C’) på nakkeniveau. Bemærk fraværet af det indre øre (ie) og spiserøret (oe) og reduktionen i størrelse af luftrøret (tr) og skjoldbruskkirtlen (th). pi, hypofyse.
Skeletdefekter
i skeletpræparater af Chrd-/- nyfødte dyr var appendikulære og lumbale knogler normale,men bunden af kraniet ogDet forreste aksiale skelet præsenterede flere defekter. Ændringer i den temporale knogle omfattede mangel på temporalis (st) og forkortelse af Kindbuen (Fig.4A, A’). Vi observerede også en betydelig hypoplasi afhyoidbenet og af skjoldbruskkirtlen og cricoid laryngeal brusk(Fig. 4B’) og unormalt lille kæbe (Fig.4c’). I bunden af kraniet optrådte alisphenoid (as)normalt, men i midtlinjen blev basioccipital (bo) og basisphenoid(bs) knogler smeltet sammen, og presphenoid (ps) var hypoplastisk(Fig. 4D, D’). Konsistentmed de histologiske fund kunne palatinhylderne ikke strække sig medialt for at danne den sekundære gane. I øret, den tympaniske ring og den otiske kapselblev reduceret og misdannet (Fig.4D’). Skeletale misdannelser blev også observeret i livmoderhalsenog thoracale regioner i rygsøjlen. Hvirvellegemer(vb) varmindre hos Chrd-/- nyfødte (Fig. 4E’), med forsinket nedbrydning og lejlighedsvis tab af andre elementer i hvirvlerne som f.eksspinøse processer, neurale buer og atlasens forreste bue(Fig. 4e ‘ ogfig. 5A’).
Skeletpræparater af vildtype og mutante nyfødte. (A-E) Vildtypeneonater. (A’-E’) Mutant kuldkammerater. Ben er farvet Medalisarin rød og brusk med Alcian blå. (A,a’) sidebillede af kraniet, der viser mikrocefali og manglen på temporalis (st) in themutant (a’). (B,B’) tracheal og laryngeal brusk i vildtype (B) og mutant (B’); TH, thyreoidea; CR, cricoid brusk; hy, hyoidben. (C,C’) sidebillede af mandiblerne; Bemærk manglen på thecoronoid (cor), condylar (con) og vinkel(an) processer i mutant (C’) kæben. (D,D’) Dorsal udsigt over bunden af kraniet. as, alisphenoid; pl, palatine; ps, presphenoid; bs, basisphenoid; bo, basioccipital; tr, tympanisk ring; oc, Otic kapsel. (E,E’) Ventral visning af den cervikale rygsøjle. Den forreste bue af atlas(aaa) ermanglende i mutanten og ossifikationscentrene i hvirvellegemerne (vb) reduceres.
fænotype af Chrd-/- embryoner ved E14.5. (A, A’) skeletpræparat af vildtype (A) og (A’) mutante kuldkammerater.Pilespidser i en’ indikerer underudviklede vertebrale neurale buer.(B,B’) Dorsal udsigt over bunden af kraniet. Pile i B angivertilstedeværelsen af den forreste notokord. Pilespidser i B’ angiver denbrusk bro, der forbinder primordia af basisphenoid (bs) ogbasioccipital knogler (bo). OC, Otic kapsel; lc, laryngeal brusk.C, C’) udvendigt billede af vildtype (C) og mutant (C’) dyr.Bemærk det alvorlige ødem (pilespidser) og blødning i det første embryo. (D,D’) vildtype (D) ogchrd -/ – (D’) mutante hjerter. ao, aorta; pt, pulmonarytrunk; ta, truncus arteriosus. (E-F’) Koronalsektioner af embryoner af vildtype (E,F) og mutant (E’,F’). I brystkassen af mutanten (E’) er den udelte truncus arteriosus tydeligt synlig. I mutanten ses en forstørret forreste spinalarterie (asa, indsat i F’) i stedet fora notochord (no). Bemærk den slående reduktion af svælg (ph) ogfravær af eustachian tube (eu) i mutanten. da, faldende aorta.
skeletdefekterne af Chrd-mutanter var allerede påviselige ibrusk kondensationer ved E14.5 (Fig.5A, A’). Basioccipital-og basisphenoidbrusk blev misbrugt, og basioccipital-ossifikationscentret var smallere og udvidet til basisphenoid (Fig.5B, B’). Den forreste notokord, som var til stede imidline af vildtype basioccipital, var fraværende i Chrd mutanter(Fig. 5B, B’). Fraværet af anterior notokord blev bekræftet ved histologisk undersøgelse afcervikal region ved E14.5 (Fig.5F’).
knoglerne påvirket af Chrd-mutationen har meget forskelligeoprindelse. Basioccipital er rent af somitisk Oprindelse; dele afbasisphenoid stammer fra endokondral ossifikation af cephalisk mesenchym; denpalatin stammer fra intramembranøs ossifikation af neural crest-derivedmesenchyme; de otiske kapsler adskiller sig fra en blanding af paraksiale mesodermand neurale crestceller; og hyoid er strengt neural crest afledt(Le Douarin og Kalcheim,1999). Midt i en sådan mangfoldighed af slægter synes det samlende princip for fænotypen at være placeringen af misdannede strukturer i nærheden af Chrd-udtrykkende aksial mesendoderm(Fig. 1E). Denne fortolkning er i overensstemmelse med den observerede for tidlige degeneration af anteriornotochord i Chrd-/- dyr og med kravet omprechordal plade og mesendoderm afledte signaler til udvikling afkelet af hovedet (Belo et al., 1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).
DiGeorge-lignende kardiovaskulære defekter
cyanosen observeret ved fødslen kan være et tegn på hjertefejl. For at undersøge dette yderligere blev dissektioner på forskellige stadier af embryonudvikling udført. På E14.5 viste hjerterne afchrd – / – dyr et enkelt fartøj i stedet fornormale to i hjerteudstrømningskanalen(Fig. 5D, D’, E, E’).Denne tilstand er kendt hos mennesker som vedvarende truncus arteriosus og er vigtig misdannelse hos personer med DiGeorge syndrom. Manglen påadskillelse mellem den stigende aorta og lungestammen kan øgearbejdsbelastningen i højre ventrikel, der forårsager hypertrofi, såvel som vasodilatation, ødem og blødning set i E14.5-embryoner(Fig. 5C’). Som inDiGeorge syndrom, defekter i det kardiovaskulære system strækkede sig ud overudstrømningskanalen og omfattede de store kar, der stammer fra pharyngeal archarteries (Fig. 6). Hos nyfødtekrd-mutanter sluttede de fælles carotisarterier sig direkte til truncusarteriosus, hvilket resulterede i fravær af den brachiocephaliske arterie og en del af aortabuen (Fig. 6A-C).Lungearterierne stammer direkte fra den proksimale truncusarteriosus, hvilket resulterer i fravær af en fælles lungestamme(Fig. 6A-C). Derudover blev lateralitetsdefekter observeret med en unormal højre drejning af aortaen 40% af mutanterne (Fig. 6, sammenlign 6med 6F). Når dissektioner blev udført fra den bageste, detkunne ses, at afhængigt af lateraliteten af den nedadgående aorta vedtog højre eller venstre subklave arterier en unormal retroøsofagealposition (Fig. 6D-F). Similardefects er blevet beskrevet i chick embryoner med neurale crest celler ablations(Kirby et al., 1983), og inmice, der bærer sletninger i DiGeorge congenic-regionen(Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001) ormutationer i TBH 1 og Fgf8 (Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome og Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).
arterielle defekter hos Chrd-/- nyfødte. Frontal (A-C) og posterior(D-F) udsigt over udstrømningskanalen og store skibe af vildtype (A,D) og to Chrd-/ – (B,C,E,F) nyfødte. Auriklerneer blevet fjernet for at lette observation. I vildtype (A,D) er aorta(Ao) og lungestammen (Pt) adskilt. Aorta begynder til venstreventrikel og drejer til venstre. Den nedadgående aorta (DAO) er placeret påvenstre side af spiserøret (oe). Den brachiocephaliske arterie(bc) grenefra højre side af aortabuen, der giver anledning til højre fælles carotid (rcc) og højre subclavian arterier (rs). Den venstre almindelige carotis (lcc)og den venstre subclavian (ls) kommer direkte ud af aortabuen. (B, E)Mutant dyr med venstre drejende aortabue. Venstre og højre commoncarotider stammer fra truncus arteriosus (Ta). Den brachiocephaliske arterier fraværende, og den højre subclavian er unormalt placeret posterior til theoesophagus. Venstre (lpa) og højre (rpa) lungearterier stammer framest proksimale del af truncus. (C,F) Mutant dyr med højresvingaorta bue. Fyrre procent af mutanterne præsenterer unormal højre drejning afaorta. Den nedadgående aorta er placeret på højre side af spiserøretog den venstre subclavian løber bagud til den. Flere fartøjer har været skitseret for at lette observationen. rl, højre lunge; ll, venstre lunge; lpv, leftpulmonal vene; rpv, højre lungevene.
ved fødslen var kun 49% af de forventede chrd homosygøse mutantergenopdaget. Imidlertid var 48 af de forventede 56 (86%) Chrd-/-embryoner stadig i live i kuld dissekeret ved E14.5, en frekvens, der ikke var væsentligt forskellig fra den, der blev observeret ved E8.5 (88%). Den kraftige stigningi dødelighed efter E14.5 falder sammen med den fulde manifestation afkardiovaskulær fænotype, og antyder, at kredsløbssvigt er envigtig årsag til dødelighed af Chrd-/- embryoner undersent drægtighed.
pharyngeal abnormaliteter
for at bestemme begyndelsen af pharyngeal fænotype dissekerede vi gravidekvinder fra heterosygøse parringer på forskellige tidspunkter efter coitum. På E9.0, astage, hvor Chrd udtrykkes i pharyngeal endoderm,Chrd-/- embryoner kunne identificeres ved en indrykning ihalsregionen (Fig.7A’, pil). Mutanternes otiske vesikler blev reducerettil halvdelen af deres normale diameter (Fig.7A’, pilespidser) og den anden (hyoid) svælgbue varmanglende. Pharyngeal buer tre til seks aldrig dannet i mutante embryoner(Fig. 7B ‘ og data ikke vist). De manglende eller misdannede strukturer er enten direkte forstadier ellerpille induktive roller under udviklingen af mange af de organer, der er defekte ved fødslen i Chrd-/- mus. Da de fleste afphenotypiske abnormiteter observeret hos nyfødte mutanter har deres embryologiskeoprindelse i pharyngeal endoderm og peripharyngeal region, analyserede viekspressionen af en række gener, der vides at have vigtige udviklingsroller i human arvelig sygdom.
Pharyngeal defekter i Chrd-/- embryoner ved midten af svangerskabet.(A,a’) eksternt billede af vildtype (A) og mutant (a’) E9. 0embryos; mutanter præsenterer en fuldt penetrerende fænotype bestående i reduktionaf den otiske vesikel (pilespidser), fravær af anden (hyoid) pharyngeal bueog en iøjnefaldende indrykning i nakken (pil). (B,B’) helmonteret insitu-hybridisering af E9.5-embryoner med en Soks10-probe, der mærker gliaceller. De trigeminale (tr) og vestibulocochlear (vc) ganglier er deformeret og fordrevet i mutanten (B’). C, C’) 3hele-monterede in situ-hybridisering af E10.5-embryoner. Neurale kamceller (pilespidser), der migrerer gennem perifaryngeal regionen i nærheden af hjertet (h) er fraværende i det mutante embryo (C’). md, mandibularkomponent af den første pharyngeal arch; hy, hyoid eller anden pharyngeal arch;DM, dermomyotomes; fl, forben. Unormale aksonale fremspring fratrigeminal ind i vestibulo-cochlear er angivet (pilespids). Deepibranchiale placode-afledte geniculate (g), petrosal (p) og nodose (n)ganglier er fraværende i mutanten. ov, Otic vesikel; drg, dorsale rodganglier.(D-F’) helmonteret in situ-hybridisering med Pak9-sonde.(D,D’) sidebillede af E9.5 vildtype (D) og mutant (D’) embryo, der er fremstillet gennemsigtigt. Paks9 pharyngeal ekspression erreduceret i mutanten. pe, pharyngeal endoderm; pg, postanal tarm. (E,E’)Dorsal visning af de samme embryoner; i mutanten er svælget reduceret, og pharyngeal poser II, III og IV er fraværende. (F,F’) sidebillede af vildtype-og mutantembryoner af 10,5. Bemærk manglen på Paks9 udtrykspecifikt i pharyngeal endoderm (pe) af mutanten. fm, facial mesenchyme; sc, sclerotome.
vi undersøgte først udtrykket af Paks3, en transkriptionsfaktorekspresseret i neural crest, dorsal neural tube og somites(Goulding et al., 1991). Inhumans, PAKS3 er muteret i neural crest sygdomme betegnet thaardenburg syndrom type 1 og 3 (Strachan and Read, 1994) oger en co-regulator sammen med SOKS10 af microphthalmia orMITF genet (Bondurand et al., 2000), transkriptionsfaktoren muteret i Vardenburg syndromtype 2a hos mennesker (Tassabehji et al.,1994). Mutation af Paks3 i splotch(Sp2H) mus resulterer i hjertefejl, herundervedvarende truncus arteriosus, såvel som misdannelse af thymus, thyroidog parathyroidkirtler (conve et al.,1997). Vi fandt ud af,at Paks3 ekspression varuadskillelig mellem mutante og vilde embryoner ved E7.5 (ikke vist), men ved E10.5 blev der observeret signifikante forskelle. 3-positiveneurale crest celler, der migrerer gennem pharyngeal buer 3, 4 og 6 (Fig. 7C, pilespidser) var sjældent detekterbare hos Chrd-/- dyr (Fig. 7C’). Disse neuralcrest-celler befolker septum, der adskiller aorta fra lungearterieni udstrømningskanalen eller conotruncal-regionen i hjertet(Li et al., 2000). Svigtet af hjertets neurale kam for at nå hjertet forklarer manglen på udstrømningskanalseptation og den efterfølgende kardiovaskulære fænotype observeret ichrd mutanter. Interessant nok er ekspression af Paks3 i andre væv sådansom den mandibulære (md) komponent i den første pharyngeal arch, dermomyotomer(dm) og myoblastforløbere i forbenene (fl) var upåvirket(Fig. 7C’).
dernæst udførte vi In Situ-hybridiseringer med Soks10, en genmuteret hos personer med type 4(Pingault et al., 1998) detudtrykkes i neural crest og Schvann celler. På E7. 5 var udtrykket af seks10 det samme i Chrd-/- embryoner og i deres vildtype-kuldkammerater (data ikke vist). Ved E9.5, Soks10ekspression i dorsale rodganglier (drg) af stammen var normal(Fig. 7B, B’), men fordelingen af gliaceller, der udtrykker Soks10, afslørede specifikkedefekter i organisationen af det perifere nervesystem i mutanternes nakke og hovedområde (Fig.7B’). Især viste kraniale sensoriske ganglier markeretabnormaliteter. De trigeminale (tr) og vestibulo-cochleære (vc) ganglier,svarende til henholdsvis V og VIII kraniale nerver, blev placerettættere sammen i Chrd-/- embryoner end i vildtypelittermates. Derudover unormale nervefremspring, der forbinder de to afdem blev set (Fig. 7B’, pilespids). Geniculate (g), petrosal (p) og nodose (n) ganglier,svarende til kraniale nerver VII, IK og H, var de mest berørte, viserenten en ekstrem reduktion i størrelse eller fuldstændig fravær. Disse tre ganglier stammer fra epibranchiale placoder og er kendt for at kræve induktivesignaler fra anterior endoderm for deres rette udvikling(Begbie et al., 1999). Manglen på epibranchial placode-afledte ganglier indikerer, at det udskillede proteinChrd er påkrævet for aktiviteten af det induktive signal frigivet affaryngeal endoderm.
Paks9 er en transkriptionsfaktor, der kræves til udvikling af thepharyngeal endoderm og dets derivater i musen(Peters and Balling, 1999;Peters et al., 1998). På E9.5, ekspression af Paks9 i pharyngeal endoderm ofChrd – / – embryoner var svagere end i deres vildtypelittermates (pe, Fig.7D, D’). Paks9 ekspression afslørede, at størrelsen ogformen af svælget blev ændret i Chrd-mutanterne, med pharyngealpouches reduceret til en enkelt hævelse i det forreste område(Fig. 7E, E’). Denhypoplasi af svælget blev bekræftet af histologiske sektioner af E14.5embryos, hvor den forreste endoderm optrådte som et tyndt rør, der skitserede agreatly formindsket lumen (ph, Fig.5F, F’). En af de mest almindelige årsager til denne sygdom er, at der er tale om en alvorlig sygdom.,2003). Ikke-pharyngeal regioner, hvor Paks9 mRNA ernormalt udtrykt, såsom de somitiske sclerotomer (sc) og ansigts mesenchyme(fm), viste ikke forskelle i fordelingen eller overfloden aftranscripts (Fig.7F, F’).
vi konkluderer ud fra disse undersøgelser, at ændringer i Paks3, Soks10 ogpaks9 ekspression er begrænset til et meget begrænset område af bredereekspressionsdomæner, hvilket antyder, at mangel på det udskillede protein Chrd forstyrrer specifikt lokale reguleringsveje, der virker i peripharyngealregionen omkring Chrd-udtrykkende endoderm.
Tbks1 og fgf8 ekspression kræver chordin
for at studere interaktionen mellem Chrd og gener kendt for at forårsagedigeorge eller DiGeorge-lignende fænotyper hos mus, analyserede vi ekspressionen afbks1 og Fgf8 i Chrd-mutante embryoner. Tbh1er medlem af T-boksfamilien af transkriptionsfaktorer(Papaioannou og Silver,1998). Det kortlægges inden for DGS / Vcfs 22k11 mikrodeletion hos mennesker og har for nylig vist sig at forårsage DiGeorge-lignende fænotype ved inaktivering i mus (Jerome og Papaioannou,2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al., 2002a). Ekspression af Tbh1 blev ændret ichrd – / – embryoner. Hos vildtype E7.5-dyr udtrykkes Tbks1 i foregut (fremtidig pharyngeal endoderm) og hoved mesoderm(Fig. 8A). På dette stadium viste mutante kuldkammerater en klar reduktion i niveauerne af Tbh1ekspression i de samme områder (Fig.8A’). Reduktionen i Tbh1 mRNA var lige så klari pharyngeal regionen af Chrd homosygøse embryoner ved E8.0, E8.5 oge9.0 (Fig.8B’,C’, D’). Tværgående histologiske sektionerviste, at på celleniveau overflod Tbh1 transkripterblev drastisk reduceret i endoderm, både i svælg og foregut op tilniveau af hepatisk divertikulum (Fig.8F-H’) reduktion i koncentrationen af Tbh1 mrnavar også tydelig i mesoderm, herunder hoved, splanchnic (pilespidser) ogsomatisk mesoderm(pile) i peripharyngeal regionen (Fig.8F’, G’, H’). Desuden var Tbh1-ekspression ved E9 i den mesodermale kerne af den første pharyngeal arch forskellig, strækker sig til det meste af buen, og Tbh1-transkripter varfraværende fra den otiske vesikel (Fig.8D-D’).
Fgf8 er en udskilt vækstfaktor udtrykt i en række forskelligevæv, herunder pharyngeal endoderm og nabo mesoderm(Crossley and Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Under tidlig udvikling kræves Fgf8 til gastrulation(Sun et al., 1999) og etableringen af symmetriens venstre/højre akse(Meyers og Martin, 1999). Atlater stadier af Fgf8 er påkrævet for lemmer (lem et al., 2000; Moon and Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trumpp et al., 1999) udvikling. Nylige forsøg har vist, at mus medreduceret fgf8-aktivitet præsenterer et spektrum af kardiovaskulære ogfaryngeale defekter, der nøje efterligner DiGeorge syndrom(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002). Desuden afskaffes fgf8-ekspression i pharyngeal endoderm oftbh1-/- mutanter, og begge gener interagerer genetisk underdifferentieringen af pharyngeal arch-arterierne(Vitelli et al., 2002b). AtE9, fgf8-ekspression i Chrd-mutanter er normal imid-baghjerne isthmus, frontonasal prominens og hale. I pharyngealendoderm reduceres Fgf8-transkriptionsniveauer imidlertid drastisk (Fig. 8E’). Reduktionen af tbh1-og fgf8-ekspression i Chrd-/-embryoner antydede, at begge gener virker nedstrøms for Chrd i den sameregulatoriske vej. Disse eksperimenter bestemmer ikke, om Chrder kræves til vedligeholdelse eller til induktion af Tbks1 ogfgf8 i svælg og nærliggende væv.
for at teste,om Chrd kan inducere Tbks1 og Fgf8, injicerede vi Chrd mRNA (50 pg) i det ventrale område afeksenopus embryoner på firecellestadiet. Eksplantater blev dissekeret ved tidlig gastrula, dyrket indtil søskendeembryoer nåede tidligt neurula Stadium og analyseret af RTPCR. 1 og fgf8 mRNA ‘ er blev udtrykt ved høje niveauer i hele embryoner og dorsalmarginal område (dmg) eksplantater på dette stadium og ved lave niveauer i VMG eksplantater(Fig. 8i, baner 1-3). Ved mikroinjektion øgede Chrd mRNA niveauerne af Tbh1 ogfgf8 i VM (Fig. 8i, bane 4). In situ hybridisering af Mikroinjicerede embryonerbekræftet, at Tbks1-transkriptionerne induceret af Chrd mRNA var placeret i pharyngeal endoderm (data ikke vist). Vi konkluderer, at chrd, en BMP-antagonist, kan inducere Tbks1 og Fgf8ekspression i Ksenopus-embryoner og er nødvendig for fuld ekspression af disse gener i musembryoets pharyngeal region.