Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay er en vigtig metode til transkriptionel reguleringsovervågning med afdækket viden om interaktioner mellem specifikke proteiner og en genomisk DNA-region. I betragtning af at DNA-bindende proteiner (herunder transkriptionsfaktorer og histoner) i levende celler kan krydsbindes til det DNA, de binder, anvendes ChIP til at immunopræcipitere protein-DNA–komplekset ud af cellulære lysater af et passende antistof. De immunopræcipiterede komplekser opsamles ved centrifugering, og proteiner elueres til yderligere analyse, såsom vestlig blot og LC/MS. nukleinsyreanalyse opnås gennem PCR, RT-PCR, cDNA-sekventering og mikroarray. Denne protokol giver en detaljeret procedure for at opnå en vellykket Chipassay på en hurtig og effektiv måde.
reagenser:
- 37% formaldehyd
- 1 M glycin
- cellelysbuffer: 150 mm NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton H-100, med 1 liter proteasehæmmercocktail.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Tilsæt 27 liter 37% formaldehyd pr.1 mL dyrkningsmedium for at opnå en endelig koncentration ved 1%, inkuber cellerne i 10 minutter ved stuetemperatur, mens de langsomt ryster på en rockende eller rystende enhed.
2. Tværbindingen dæmpes ved tilsætning af 141 liter 1 M glycin pr.1 mL dyrkningsmedium for at opnå en slutkoncentration ved 125 mM, cellerne inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
3. Til flydende celler: kolletceller i et 15 mL konisk rør, centrifuge ved 2.000 liter g ved 4 liter C i 5 min. Kasser supernatanten, og vask cellerne to gange med kolde PBS.
gå til trin 5.
4. For klæbende celler: fjern mediet, vask cellerne to gange med kolde PBS. Skrab cellerne i PBS i et 15 mL konisk rør, centrifuger ved 2.000 liter g ved 4 liter C i 5 minutter.
Lysis og sonikering
5. Supernatanten kasseres, der tilsættes 1 mL koldcellelysebuffer pr. 1. liter 107 celler. Opbland pelleten ved at pipettere op og ned i flere gange, og inkuber på is i 10 minutter.
6. Sonikat for at skære kromatinet i 0,5~1 kb fragment. Undgå skum og hold prøven på is.
noter:
- Sonication betingelser bør optimeres afhænger af prøven og sonicator model. Typisk har seks 15 sek pulser efterfulgt af 45 sek hvileperioder ved output 6.0 vist sig at fungere. Til analyse fragmentstørrelsen ekstraheres et lille volumen af totalt DNA fra en alikvot skåret kromatin og analyseres derefter på en agarosegel (1~2%).
- volumenerne foreslås at være 1 ml for at opretholde sonikeringseffektivitet.
7. Centrifuger ved 12.000 liter g ved 4 liter C i 10 minutter, og behold supernatanten.
8. Overfør 0,5 mL supernatant til en frisk 1.5 mL rør til DNA-fragmentanalyse.
Immunudfældning
9. Tilsæt relevante antistoffer eller normal IgG til prøven og inkuber i 15 minutter i et ultralydsvandbad ved stuetemperatur.
noter:
- Vælg IgG fra den samme art, hvor antistofferne blev produceret.
- inkubationstiden bør optimeres afhænger af antistoffet og antigenet. For antigener med et lavt ekspressionsniveau kunne inkubationen udføres ved 4 liter C natten over på en roterende platform .
10. Forbered Protein a-agaroseperler: vask perlerne tre gange med 1 mL lysisbuffer (uden proteasehæmmer), centrifuger ved 2000 liter g i nogle få sekunder ved 4 liter C og kasser derefter supernatanten.
11. Fortynd perler 1: 1 med lysis buffer og tilsæt 50 liter til prøven.
12. Inkuber ved 4 liter C i 30~45 min i en roterende platform.
13. Centrifuger ved 2000 liter g i 1 min ved 4 liter C og kasser derefter supernatanten.
14. Vask perlerne fire gange med 1 mL lysisbuffer (uden proteasehæmmer), kasser supernatanten.
DNA-oprensning og analyse
15. De vaskede perler opblandes med 100 g 10% Cheleks 100.
16. Pipette op og ned i flere sekunder, og kog derefter prøven i 10 minutter.
17. Centrifuger ved 12.000 liter g i 1 min ved stuetemperatur, og overfør supernatanten til et frisk 1,5 mL rør.
18. Rens DNA ved hjælp af et DNA-rensningssæt eller ved standard phenol: chloroformekstraktionsprotokol.
19. Opløs DNA med 50 liter ddh2o, og brug 2~10 liter af DNA-prøven (25% af reaktionsvolumenet) i PCR-reaktionerne
Lær om princippet om ChIP
Reach to our ChIP servise
hvis du har spørgsmål, bedes du kontakte os på: