mikroskopi er som standard en teknik, der giver os mulighed for at observere, snarere end at måle, biologiske begivenheder og drage konklusioner baseret på det, vi ser, snarere end baseret på nogle beregninger. Emnet for denne artikel kan derfor virke lidt overraskende, da det omhandler målingerne af kolokalisering. Mens der er situationer, hvor du kan bestemme proteinkolokalisering visuelt, vil en mere præcis bekræftelse af en gensidig fordeling af to prober ofte være nødvendig.
Hvorfor er en visuel bestemmelse af Kolokalisering utilstrækkelig?
kun hvis du har samlet billeder efter en kontrolleret protokol til kolokaliseringsanalyse (tilstrækkeligt signal i hver kanal, ingen autofluorescens eller signalblødning) er det sikkert at sige, at de to sonder kolokaliseres udelukkende baseret på observation. I dette tilfælde, hvis det grønne signal kolokaliseres med det røde signal, og billedet for det meste er gult, er der ikke behov for statistisk måling. Men hvis du ikke ser en overlapning, betyder det ikke, at den ikke er der! Det kan være, at intensiteterne på de to kanaler ikke er de samme. Den mellemliggende farve, som vi ser, kan nemlig kun vises, hvis begge Sonder har samme intensitet. Derfor kan konklusioner baseret på visuel bestemmelse ofte føre til falske negative resultater.
hvilke metoder til Overlapningsmåling findes?
mens der ikke er nogen standard tilgang til denne sag, er der to metoder, der er meget udbredt og generelt accepteret. Disse involverer enten Pearsons korrelationskoefficient (PCC) eller Manders kolokaliseringskoefficient (MCC).
disse to metoder vedrører to forskellige aspekter af kolokalisering – korrelation og co-forekomst. Pearsons koefficient er relateret til korrelationen mellem billedintensiteterne i de to kanaler. Det måler forholdet mellem signaler – om signalværdierne i den ene kanal stiger samtidigt med den anden, eller det ene signal falder, når det andet stiger. Korrelation adskiller sig fra co-forekomst, som udtrykkes matematisk gennem Manders koefficient. Dette repræsenterer dækningen af det ene signal over det andet, hvilket afslører, i hvilket omfang to sonder indtager det samme sted. Lad os undersøge dette lidt længere.
Pearsons korrelationskoefficient (PCC)
Definition: PCC afspejler det lineære forhold mellem signalintensiteter. Værdierne kan variere mellem 1 (perfekt positiv korrelation) og -1 (perfekt negativ korrelation), mens 0 betyder, at der ikke er nogen korrelation. Det er muligt at udforske PCC visuelt gennem et scattergram, hvor koordinaterne på plottet repræsenterer billedværdier (signal) i begge kanaler. Jo flere prikker, der klynger sig omkring en lige linje, jo bedre er sammenhængen mellem de to signaler
krav: PCC skal måles i regionen af interesse (ROI) for at undgå falske positive eller negative. Hvis man måler PCC over hele billedet, vil billedpunkter i baggrunden korrelere perfekt og puste PCC. I modsætning hertil, hvis målingen udføres i et område uden interesse, hvor der er en heterogen fordeling af begge kanaler, vil PCC blive deprimeret.
du kan vælge ROI manuelt eller ved tærskelværdi for at udelukke baggrund. Uanset hvordan du gør det, skal du være forsigtig, især når du tærskler. Valget af ROI skal omfatte alle de relevante regioner i cellen / cellerne, dvs.hvert sted, hvor en sonde kan forventes at distribuere. Hvis du bruger en intensitetsbaseret metode til at vælge ROI (thresholding), kan du utilsigtet udelukke relevante resultater. Hvordan kan det ske? Du kan have en region med gensidig udelukkelse, hvor ingen af etiketterne vises, og dette kan være et biologisk relevant resultat (begge molekyler udtrykkes ikke på det sted i cellen). Thresholoding vil dog ikke omfatte denne region i ROI, hvilket sætter dig i fare for at miste relevante resultater.
anbefales til: PCC skal bruges på billeder, hvor der er et lineært forhold mellem intensiteter. Hvis dataene passer til en mere kompleks model, fungerer PCC ikke godt. En anden metode bør også vælges, hvis der er en ujævn overlapning, hvor prober co-distribuerer, men i forskellige proportioner. Dette kan forekomme, når GFP bruges som en sonde. Dens ekspressionsniveau kan variere mellem celler og potentielt forårsage depression af PCC på grund af høj intercellevariabilitet.
Manders Kolokaliseringskoefficienter
Definition: MCC er en metrisk, der beskriver co-forekomst – fraktionen af et protein, der kolokaliserer med det andet. MCC vil give dig et godt mål for kolokalisering, når du mærker et protein i en vesikel og vil se, hvordan det kolokaliserer med en bestemt struktur i en celle, siger en mikrotubule. Hvis vi antager, at alle vesikler kolokaliseres med mikrotubuli, men kun en andel af mikrotubuli kolokaliseres med vesiklen, kan du beregne MCC for hver kanal og få en metrisk, der kvantitativt beskriver denne fraktionerede overlapning.
krav: fangsten med MCC er, at det kræver fjernelse af baggrund. Den vanskeligste del her er at indstille et afskæringspunkt for intensitet, der muliggør baggrundssubtraktion. MCC måler den komplette fluorescens af en sonde i hvert punkt over nul. Imidlertid er over nulpunkter ekstremt sjældne på grund af faktorer som: autofluorescens, lys lækage, ikke-specifik mærkning, eller fluorescens fra ude af fokus billede sletter. Måling af MCC kræver derfor et omhyggeligt valg af tærsklen (cutoff).
den første måde at gøre dette på er global tærskelværdi, hvor du trækker en tærskelværdi fra hvert punkt, så hvert niveau under den valgte cutoff vil være baggrund, og hvert punkt ovenfor vil falde i en region af interesse. Selvom dette er meget intuitivt, er global tærskning temmelig rå og kan føre til uønskede situationer som udelukkelse af billedpunkter med lav værdi, der er tæt på baggrunden, men faktisk er positive.
en mere automatisk og mindre subjektiv mulighed er Costes-metode, hvor tærsklen estimeres ved at beregne PCC flere gange. Dette tjener til at definere rækkevidden af billedværdier, der er positive og derfor ikke bør udelukkes. PCC beregnes for forskellige grupper af billedpunkter, og de billedværdier, for hvilke PCC er lig med eller tæt på nul, tages som tærskelværdierne. Ikke desto mindre bør det også kontrolleres visuelt, da det i billeder med lavere signal / støjforhold kan identificere et meget lavt tærskelniveau, så det ikke skelner mærkede strukturer fra baggrunden.
anbefales til: når det biologiske spørgsmål i dit eksperiment vedrører omfanget af protein/strukturer overlapper hinanden, bør MCC være det valgte mål. Disse koefficienter fortolkes mere intuitivt end PCC og er uafhængige af signalproportionalitet (forskellene i antallet af strukturer mærket af hver sonde).
før du begynder din analyse
uanset hvilket valg til måling af kolokalisering du vælger, er det meget vigtigt, at billedsamlingen udføres på en korrekt måde. Prøv at kontrollere så mange faktorer som muligt, og forbered et sæt kontrolprøver, der giver dig mulighed for at overvåge så mange variabler som muligt.
Husk, at visuel kolokaliseringsbestemmelse påvirkes af mange faktorer, herunder observatørens subjektivitet, det faktum, at hver enkelt persons hjerner kan se farver forskelligt, en mulig farveblindhed hos observatøren og den rumlige opløsning, der blandt andet bestemmer billedstørrelsen. Sørg for at behandle de billeder, du er ved at analysere på en ensartet måde, og husk, at enhver ukontrolleret manipulation kan få dig til at miste relevant information.
og sidst men ikke mindst
disse beregninger er implementeret i de fleste billedanalyseprogrammer, f.eks. ImageJ og Volocity. Men da måling af kolokalisering stadig er et noget forvirrende felt, er der behov for forbedringer, så hold styr på de nye versioner og pakker til programmet.
hvordan måler du kolokalisering? Lad os vide ved at skrive i kommentarfeltet!
litteratur:
Dunn KV, Kamocka MM, McDonald JH. En praktisk vejledning til evaluering af kolokalisering i biologisk mikroskopi. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Kolokaliseringsanalyse i fluorescensmikroskopi. I: Taatjes, Douglas J., Roth, J Larrgen (Red.), Celleafbildningsteknikker: metoder og protokoller, Ny York: Humana Press, 2012, s.97-109
Mcdonald JH, Dunn KV. Statistiske tests for målinger af kolokalisering i biologisk mikroskopi. Tidsskrift for mikroskopi. 2013; 252(3): 295-302
har dette hjulpet dig? Så del venligst med dit netværk.