mekanismer for kromosomal omlejring i det humane genom

patologiske DSB ‘er defineres vilkårligt som Dsb’ er, der ikke tjener noget fysiologisk formål og kan føre til celledysfunktion.

tilfældige DNA-brud på grund af ioniserende stråling eller iltende frie radikaler

i mange kromosomale omlejringer synes DSB ‘ erne ved et eller begge gener at være placeret tilfældigt inden for store regioner i mange kilobaser. Tilfældig positionering og den tilsyneladende mangel på sekvenstilbøjelighed antyder sekvensspecifikke DSB-mekanismer såsom iltning frie radikaler, ioniserende stråling eller mindre almindeligt spontan DNA-rygradhydrolyse.

cirka halvdelen af den naturlige ioniserende stråling af miljøet stammer fra naturlige tungmetaller på jorden, såsom uran, thorium og endda kalium. Den anden halvdel af den ioniserende stråling stammer fra kosmisk stråling, der ikke er helt blokeret af atmosfæren. 3 108 ioniserende strålingspartikler gennem hver af os hver time og producerer hydroksyl frie radikaler fra vand i deres kølvand. Denne kanal af frie radikaler forårsager klyngeskader på DNA og derved bryder begge DNA-tråde.

cirka 0,1% af det ilt, vi indånder, omdannes til frie radikaler . Dette genererer 3 1022 frie radikaler i timen inden for hver af os, og disse skadelige frie radikaler fordeles over de 1014 celler i menneskekroppen. Frie radikaler forårsager overvejende enkeltstrenget DNA-skade, men to nærliggende sådanne begivenheder kan resultere i en DSB.

RAG-handling på kryptiske RSS-steder på steder uden for målet på en sekvensspecifik måde: V(D)J-type pauser

RSS heptamer/nonamer-konsensussekvensen er på ingen måde unik for Ig-og TCR-loci, og RAG-komplekset kan skære på steder, der adskiller sig væsentligt fra 16 bp-konsensus . Det minimale motiv til RAG nicking er kun CAC. Således kan RAG-komplekset virke på RSS-lignende ikke-antigenreceptor locus steder, betegnet kryptisk RSS (cRSS). Dette forekommer i mange af de omlejringer, der observeres i humant T-celle akut lymfoblastisk lymfom . I disse tilfælde, i stedet for RAG kompleks parring en 12-RSS med en 23-rss, en 12-RSS par med en 23-cRSS eller en 23-RSS par med en 12-cRSS. Vi kalder disse pauser V(D)J-type pauser, fordi de forekommer via den samme mekanisme som normal V (D)J rekombination, uanset det faktum, at et af stederne er uden for det sædvanlige antigenreceptor loci (det vil sige det er off-target).

RAG-handling ved DNA-boblestrukturer og andre heterologiregioner på en strukturspecifik måde

ud over dens sekvensspecifikke skæremåde kan RAG-komplekset også nick på en strukturspecifik måde på overgangssteder fra dsDNA til ssDNA, såsom forekommer ved kanterne af boble-DNA-strukturer eller endda uoverensstemmelser med en base . En sådan aktivitet af RAG-komplekset kan være opstået, fordi RAG-komplekset er vant til at skabe hårnålestrukturer, hvilket indebærer betydelig DNA-forvrængning. Derfor er enhver region med mismatch eller glidning et potentielt mål for nicking af RAG-komplekset i lymfoide celler.

RAG-medieret transposition som en mekanisme til kromosomal omlejring

fra 1998 til 2007 foreslog flere laboratorier, at RAG-komplekset kunne indsætte de stumpe RSS-holdige ender fra V(D)J rekombination, betegnet signalender, til nye placeringer i genomet. Dette kaldes RAG transposition, og forekommer på et lavt niveau ved hjælp af en afkortet form af RAG proteiner kaldet core RAGs (gennemgået i ). Imidlertid viste bestræbelserne på at finde RAG-transponeringshændelser in vivo, at disse var meget mindre almindelige end tilfældig integration af DNA . Endelig er der ingen eksempler på humane lymfoide maligniteter (eller nogen anden form for malignitet), hvor genomet blev ændret ved en RAG-transpositionel indsættelse af signalender (eller enhver anden tilsyneladende variant af en sådan transposition).

hjælpeaktion på steder uden for målet

som nævnt i ovenstående diskussion af rekombination af klassekontakt kan hjælp konvertere C til U eller methyl C eller T i enhver region i ssDNA. Dette ser ud til at forekomme ikke kun ved skiftesekvenserne og variable domæner i Ig loci, men også på nogle patologiske steder, såsom nogle onkogener som c-myc . Når disse regioner rammes af støtte, kan de opretholde punktmutationer eller DSB ‘ er . Hjælpeaktion i IgH-omskifterregionen under CSR og uafhængig hjælpeaktion ved c-myc-genet for at skabe en DSB menes at være grundlaget for de to initierende DSB ‘ er i både mus og humane C-myc-translokationer . Man kunne betragte pauser af denne type som CSR-type pauser (som nævnt ovenfor i diskussionen om rekombination af klassekontakt) eller SHM-type pauser, hvor SHM henviser til hjælp initierede begivenheder af den type, der ligner det, der normalt forekommer i somatisk hypermutation.

formodet kombineret virkning af HJÆLP og klude på CpG-steder: CpG-type pauser

for nylig rapporterede vi, at DSB ‘ er på visse steder i Pro-B/pre – B-trintranslokationer-bcl – 2 fra t(14;18), bcl-1 fra t(11;14) og E2A fra t(1;19) – har en stærk tilbøjelighed til at forekomme ved Dinucleotidsekvensen CpG.

bcl-2-translokationen er den mest almindelige translokation i kræft, der forekommer hos >90% af follikulære lymfomer og en tredjedel af diffuse store cellelymfomer. Halvtreds procent af pauserne ved bcl-2-genet forekommer inden for major breakpoint region (MBR), som er et 175 bp hotspot i 3′ mest ekson i regionen, der koder for 3 ‘ UTR. To mindre hyppigt anvendte hotspots er placeret 18 og 29 kb yderligere distalt til bcl-2-genet, henholdsvis 105 BP bcl-2 intermediate cluster region (icr) og 561 BP bcl-2 minor cluster region (mcr). Ethvert af CpG-lokaliteterne inden for et af disse tre bcl-2-translokationsområder kan være et mål for en DSB . Tretten procent af bcl-2 translokationspauser er placeret i icr og 5% i mcr.

brugen af CPG ‘ er gælder også for bcl-1 major translokation cluster, som er den placering, der er involveret i T(11;14) translokationen. Bcl-1-translokationen forekommer i næsten alle mantelcellelymfomer, hvor 30% af pauserne forekommer ved 150 BP bcl-1 major translokation cluster (MTC).

CpG-type pauser forekommer også i en tredje lymfoid malignitet, t (1;19) i en lille procentdel af præ-B ALLs, en translokation, der forekommer mellem Pbks1-genet og E2A-genet. Pauserne ved E2A-genet forekommer i et område på kun 23 bp, og disse DSB ‘ er er også signifikant grupperet omkring CpG-steder . Alle tre translokationer, der involverer bcl-2, bcl-1 og E2A, forekommer i pro-B/pre-B-stadiet af B-celleudvikling.

bcl-2 MBR er reaktiv med en kemisk sonde til enkeltstrenghed kaldet bisulfit . Ligesom bcl-2 MBR er denne bcl-1 MTC relativt lille (150 bp) og har en lignende reaktivitet som bisulfit . Disse stærkt bisulfit reaktive områder er rige på kører af Cs. Baseret på cirkulær dikroisme, røntgenkrystallografi, NMROG kemisk sondering, sådanne kørsler af Cs har tendens til at vedtage en DNA-struktur, der er mellemliggende mellem B-form DNA og A-form DNA, betegnet B/A-mellemprodukt . B / A-mellemstrukturen har hurtigere åbningskinetik, der måske tegner sig for en del af den observerede stigning i bisulfitreaktivitet. Sådanne usædvanlige DNA-regioner kan være mere tilbøjelige til glidehændelser, måske induceret af DNA-replikation eller transkription. Dette kan derefter redegøre for deres sårbarhed i minichromosomale rekombinationsanalyser .

Cs for CPG ‘ erne inden for eller direkte ved siden af disse b/a-mellemliggende områder har øget risiko for at gennemgå deaminering . Denne deaminering gælder ikke for alle Cs i regionen, men kun Cs, der er inden for CpG-steder. Det eneste karakteristiske træk ved sådan Cs inden for CPG ‘ er er, at de kan methyleres af DNA-methyltransferase. Når regelmæssig Cs deaminere, de bliver U, hvilket resulterer i en U:G mismatch. Men når methyl Cs deaminere, de bliver T, hvilket resulterer i en T:G mismatch. Reparationen af U:G-uoverensstemmelser er meget effektiv, men reparationen af T: G-uoverensstemmelser er ikke effektiv. Faktisk er T: G mismatch reparation så ineffektiv, det tegner sig for omkring halvdelen af punktmutationerne ved p53-genet på tværs af en bred vifte af humane kræftformer. Disse T: G mismatch sites er altid på CpG sites.

Hvad forårsager pausen på disse T: G mismatch sites? Interessant nok synes denne deaminering ved disse lymfoide translokationshotspots at forekomme i præ-B-fasen af differentiering. Dette er stadiet af B-celleudvikling, når d til J rekombination forekommer mest kraftigt. Da bcl-2-og bcl-1-translokationerne forekommer på dette stadium, synes dette sandsynligvis at være translokationsstadiet. Vi har vist, at KLUDKOMPLEKSET kan forårsage en DSB på steder med små boblestrukturer, og endda uoverensstemmelser med enkelt basepar. (Som nævnt ovenfor afspejler denne handling fra RAG-komplekset dens strukturspecifikke nuklease-aktivitet, måske et træk, der afspejler de strukturspecifikke handlinger fra RAG-komplekset under hårnåldannelsestrinnet af V(D)J rekombination.) Derfor har vi foreslået, at RAG-komplekset gør DSB ‘ erne på stederne for T:G mismatch .

hvis RAG-komplekset forårsager DSB ‘ erne på CpG-steder, hvorfor forekommer sådanne CpG-type pauser ikke i præ-T-celler, som også udtrykker RAG-komplekset? B-cellelinien udtrykker en cytidindeaminase til rekombination af klasseskift og somatisk hypermutation. Som nævnt ovenfor kaldes dette aktiveringsinduceret deaminase (AID). Støtte udtrykkes i B-celler, men ikke andre somatiske celler. Støtte udtrykkes mest i B-celler, når de er i germinalcentrene. Imidlertid er der beskrevet et lavt niveau af HJÆLPEEKSPRESSION i præ-B-celler . Desuden menes B-celler, der bare forlader knoglemarven, kaldet overgangsb-celler, også at udtrykke hjælp . Der er derfor en periode, hvor B-celler afslutter V(D)J-rekombination og begynder at udtrykke hjælp, når både AID og RAG-komplekset er til stede i B-cellerne. Støtte har vist sig at være i stand til at deaminere methyl C til T. Derfor foreslår vi, at støtte sandsynligvis er ansvarlig for mutationen af meC til T på CpG-steder i tidlige B-celler. Den resulterende t:G-mismatch skæres derefter af RAG-komplekset, hvilket resulterer i en DSB. Denne model forklarer tre toppe af translokation placeret inden for bcl-2 MBR, som alle er centreret på CpG-steder .

andre årsager til patologisk DSB ‘ er af ukendt mekanisme

visse translokationer er stærkt forbundet med type II topoisiomerasehæmmerbehandling . Efter en sådan behandling udvikler nogle patienter sekundære maligniteter med disse karakteristiske translokationer. Topoisomeraser foretager generelt enkelt-eller dobbeltstrengede pauser for at vinde eller slappe af DNA, således har de en nuklease-aktivitet som en del af deres funktion. Efter vikling eller afvikling af DNA ‘ et forsegler de normalt pausen(erne). Det er blevet foreslået, at afbrydelse eller forebyggelse af genlukning kan resultere i stabile pauser set i kromosomale omlejringer .

nogle DSB ‘ er opstår på steder i nærheden af direkte eller inverterede DNA-gentagelser. Sådanne gentagelser kan give anledning til gled DNA-strukturer indeholdende regioner af enkeltstrenget DNA, som kan være mål for spaltning. Det bedste eksempel på dette er den forfatningsmæssige translokation t(11;22)(23.kvartal;11. kvartal), som indeholder et At-rigt palindrom på flere hundrede baser med potentiale for korsformet dannelse.

kombination af flere DSB-mekanismer inden for en omlægning

da to DSB ‘ er er nødvendige for at generere en translokation, er de to pauser ofte ikke relateret til hinanden. I bcl-2-og bcl-1-translokationerne er for eksempel pausen ved IgH-locus en v(d)j-type pause genereret af den sekvensspecifikke virkning af RAG-komplekset under V(D)J-rekombination. (Man kunne betragte dette som en fiasko i færdiggørelsen af den normale V(D)J rekombinationsproces .) DSB ved bcl-2 eller bcl-1 locus er en CpG-type pause, der er blevet foreslået at skyldes den sekventielle handling af HJÆLP og den strukturspecifikke nicking-aktivitet i RAG-komplekset .

selv inden for et givet sted kan der være en bred vifte af DSB-mekanismer. SCL og LMO2 loci opretholder overvejende begge V(D)J-type DSB ‘er, men en tredjedel eller flere af DSB’ erne er uforenelige med sekvenskravene til V (D) J-type DSB ‘ er, og disse kan skyldes skader på frie radikaler, ioniserende stråling eller topoisomerasefejl. Forskellige loci inden for en enkelt celle er derfor tilbøjelige til forskellige typer DSB-mekanismer.

Replikationsinduceret DSB ‘ er

under DNA-replikation kan sletninger opstå på grund af glidning af syntetiseringsstrengen på skabelonstrengen. Kromosomale omlejringer, der forekommer ved specifikke hotspots, hvad enten det er i kræft i somatiske celler eller under gametogenese/indledende udviklingsafdelinger som forfatningsmæssige translokationer, kaldes tilbagevendende translokationer, der kan ses på tværs af mange patienter. Ikke-nuværende translokationer er dem, der forekommer forskellige steder fra en patient til en anden, men ændrer eller inaktiverer et gen, der forårsager en sygdom. I modsætning til de tilbagevendende translokationer, som vi har diskuteret i kræft ovenfor, de mekanismer, der forårsager strengudvekslingen i ikke-nuværende translokationer, ser ud til at involvere skabelonskift under replikativ DNA-syntese. Disse skabelonomskiftere kan forekomme i små regioner af DNA-sekvenshomologi, såsom 5 bp. Denne skabelonskift er blevet kaldt mikrohomologi-medieret brudinduceret replikation (MMBIR) eller Gaffelstop og Skabelonskift (FoSTeS). For ikke-nuværende translokationskryds, der involverer flere lange sekvensstrækninger fra regioner i genomet, der normalt er adskilt fra hinanden, flere skabelonskiftehændelser er blevet foreslået som en mekanisme .