kromosom 20-sletninger i myeloide maligniteter: reduktion af det fælles slettede område, generering af en PAC/BAC-contig og identifikation af kandidatgener

Kromosombånd og maling

knoglemarvskromosompræparater af 107 tilfælde med myeloide lidelser blev analyseret ved hjælp af G-banding for at vurdere størrelsen af sletningen af den lange arm af kromosom 20. Som tidligere beskrevet (Nacheva et al., 1995b), to kategorier af 20K – sletning blev identificeret-store sletninger (59 tilfælde), hvilket resulterede i tab af begge Giemsa-mørke bånd fra 20K (figur 1a, top) og små sletninger (48 tilfælde), hvor et Giemsa-mørkt bånd forbliver (figur 1a, bund). Vi fokuserede derefter på sidstnævnte gruppe af patienter (opsummeret i tabel 1).

FISKEANALYSE ved anvendelse af en kromosom 20-maling blev udført på de 48 prøver med en lille 20V-sletning. I seks tilfælde blev’ 20K-sletningen ‘ afsløret på grund af kryptiske omlejringer. I et tilfælde identificerede samtidig anvendelse af maling til kromosomer 15 og 20 en markør afledt af kromosom 15, men to normale kromosom 20 homologer (figur 1b). I de resterende fem tilfælde viste kromosommaleri tilstedeværelsen af en ubalanceret translokation med et tilbagevendende breakpoint ved 20k11.2 og variable kromosompartnere (figur 1C). I alle fem tilfælde var der(20) markøren det eneste translokationsprodukt, der blev tilbageholdt i genomet. Desuden viste FISKEKORTLÆGNING, at brudpunktet på kromosom 20 var forekommet i et område, der var proksimalt til D20S107 og bekræftet tab af resten af den lange arm af kromosom 20 (data ikke vist). Disse resultater vil blive rapporteret i detaljer andetsteds.

i de resterende 42 tilfælde var kromosommaleri i overensstemmelse med en lille interstitiel deletion på 20K (figur 1D). Størstedelen (33 tilfælde) bar en 20K sletning som den eneste karyotypiske abnormitet. I de resterende ni tilfælde blev 20K-sletningen ledsaget af forskellige yderligere kromosomafvigelser (tabel 1). Alle 42 tilfælde med en lille 20V-sletning blev udsat for yderligere FISKEKORTLÆGNING med locus-specifikke prober.

analyse af Sletningskort

de 42 patienter med små 20K-sletninger blev analyseret af FISH ved hjælp af en centromerisk PAC (CEP20), en PAC-hybridisering til et distalt område på 20k (LSI 20k13) og en PAC-hybridisering inden for CDR (LSI D20S108). I hver patient blev der observeret signaler fra både LSI 20k13 og CEP20, men ikke LSI D20S108 på det slettede kromosom 20, der bekræfter tilstedeværelsen af en interstitiel deletion (opsummeret i figur 3). Metafaser fra hver patient blev derefter hybridiseret med PACs–kortlægning ved grænserne for den kendte MPD og MDS/AML CDRs-D20S107, som ligger ved den proksimale grænse for CDRs og D20S176, som ligger telomer af den distale grænse for CDRs (Bench et al., 1998a; Vang et al., 1998).

hos 37 patienter (25 med MDS eller AML, 12 med MPD) kunne begge prober ikke producere et signal på det slettede kromosom 20, der demonstrerede tilstedeværelsen af omfattende sletninger, som ikke ville hjælpe med at forfine cdr ‘ erne. Sådanne prøver blev ikke undersøgt yderligere. Hos fire patienter med MDS (DB53, MH40, DB122 og DB214) og en med MPD (JH41) gav en af de to prober imidlertid et signal på det slettede kromosom 20, og disse prøver blev analyseret mere detaljeret.

ud over de 42 patienter med små 20K-sletninger, som blev analyseret af FISH ved hjælp af locus-specifikke prober, blev yderligere seks patienter med en 20K-deletion (fire med MDS, to med MPD), fra hvilke knoglemarvsmetafaser ikke var tilgængelige, analyseret ved hjælp af mikrosatellit PCR. DNA fra oprensede granulocytter og T-celler blev analyseret ved hjælp af et stort panel af polymorfe markører, der spænder over MPD og MDS/AML CDRs (tabel 2). Alle fire MDS-patienter havde sletninger, der strakte sig ud over grænserne for den offentliggjorte CDR. Hos en af de to MPD-patienter (RB42) reducerede den centromere grænse for sletningen imidlertid MPD CDR betydeligt (figur 2, Tabel 2).

reduktion af det fælles slettede område hos MDS/AML-patienter

foreløbig FISH-analyse identificerede fire MDS-patienter med sletninger, der gik ind i MDS / AML CDR. I hvert tilfælde var 20K-sletningen til stede i alle undersøgte metafaser. I tre tilfælde (DB53, DB214 og MH40) var 20K-sletningen til stede som en eneste abnormitet. Hos patient DB122 var 20K-deletionen den oprindelige eneste abnormitet med to subkloner indeholdende trisomi 21 eller trisomi 8 og trisomi 21 ud over 20k-deletionen også til stede. Disse fire tilfælde blev undersøgt ved hjælp af yderligere locus-specifikke prober for at fastslå sletningsgrænserne.

den proksimale grænse for MDS/AML CDR blev raffineret af patienterne DB53, MH40 og DB122. Den proksimale grænse for sletningen i DB53 lå mellem D20S107 og vi-11538 (figur 3), en afstand på cirka 400 kb. For patient MH40 gav en PAC indeholdende vi-11538 (dJ357E14) konsekvent anledning til et reduceret signal i overensstemmelse med tilstedeværelsen af det proksimale deletion breakpoint inden for denne PAC (figur 3). Desuden lå den proksimale grænse for sletningen i patient DB122 mellem sts-R52161 og stSG25449 (figur 1e,f), en afstand på mindre end 200 kb (figur 3 og 4). Dette repræsenterer en stor forfining af den proksimale grænse for MDS/AML CDR.

Patient DB214 tillod betydelig forfining af den distale grænse for MDS/AML CDR. Den distale grænse for denne sletning lå mellem Vi – 12515 og stSG40369 (figur 1g,h), en afstand på mindre end 100 kb (figur 3 og 4).

disse data reducerer derfor MDS/AML CDR betydeligt til en region, der ligger mellem PAC dJ620E11, som indeholder sts-R52161, og PAC dJ196H17, som indeholder vi-12515 (figur 3 og 4). Bakterieklonen contig præsenteret nedenfor viser den fysiske størrelse af denne region til at være cirka 2,6 Mb.

reduktion af det fælles slettede område hos MPD-patienter

hos patient JH41 (diagnose PV) var den proksimale grænse for sletningen tidligere blevet bestemt af mikrosatellit PCR til at ligge mellem D20S438 og D20S107 (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, som indeholder D20S107 (figur 4), gav konsekvent anledning til et reduceret signal i overensstemmelse med tilstedeværelsen af det proksimale deletion breakpoint inden for denne PAC (figur 3).

granulocytter og T-celler fra yderligere to patienter blev undersøgt ved anvendelse af mikrosatellit PCR (tabel 2). En patient med PV (RB42) viste retention af heterosygositet ved D20S108, men tab ved D20S858 (figur 2, Tabel 2). Det proksimale breakpoint for sletningen hos denne patient lå mellem D20S108 og D20S858, en afstand på mindre end 200 kb (figur 3 og 4).

disse data reducerer i høj grad MPD CDR, som nu er flankeret af D20S108 (denne undersøgelse) og D20S481 (Vang et al., 1998). Den anslåede fysiske størrelse af denne region er 2.7 Mb, ved hjælp af data fra bakterieklonen contig præsenteret nedenfor. Overlapningsområdet mellem de nye MDS/AML og MPD CDR ‘er definerede en kombineret’ myeloid ‘ CDR på 1,7 Mb (figur 3).

en bakteriel klonkontig, der spænder over MPD og MDS/AML almindelige slettede regioner

vi havde tidligere konstrueret en 11 Mb YAC contig af denne region af kromosom 20 (Bench et al., 1998a). For at producere et mere detaljeret fysisk kort, vi har nu konstrueret et sammenhængende PAC-og BAC-baseret kort. PAC-og BAC-kloner blev identificeret ved hybridisering af STSs til genomiske biblioteker (Ioannou et al., 1994; Et al., 1998). Kloner blev overlappet ved hjælp af begrænsning fingeraftryk (Gregory et al., 1997) og STS-indholdskortlægning, der gør det muligt at gruppere kloner i contigs. For at bygge bro over contigs blev nye STSs-og DNA-prober, udviklet fra enderne af contigs, brugt til yderligere biblioteksscreening. Nye PACs og BACs blev derefter slået sammen til contigs på samme måde, indtil der blev produceret et sammenhængende kort.

bakterieklonen contig indeholder i alt 456 bakteriekloner, hvoraf 376 er PACs og 80 er BACs. Det strækker sig fra D20S607 til SEMG1 og omfatter 202 DNA-markører, hvoraf 185 er STSs og 17 er DNA-prober. Størrelsen af contig var baseret på et gennemsnit på 3,5 kb pr HindIII fingeraftryksbånd (P Deloukas (2000), upublicerede resultater). Den estimerede størrelse af contig blev beregnet som 5 Mb ved at gange det samlede antal forskellige fingeraftryksbånd inden for contig med 3,5. En repræsentation af kortet, der illustrerer den minimale flisebelægning og PACs, der blev brugt til FISKEFORSØG, er vist i figur 4. En fuld version af kortet kan findes på http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name= Chr_-20ctg125&class=Map.

identifikation af udtrykte sekvenser

treogfyrre unikke Est ‘ er var placeret mellem D20S607 og stSG34035 inklusive. Af disse blev 34 Est ‘er kortlagt ved hybridisering til en’ polygrid ‘ af PACs og BACs eller ved koloni PCR af bakteriekolonier indeholdende PACs eller BACs (figur 4). Yderligere ni Est ‘ er, der tidligere er kortlagt i denne region af kromosom 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) blev placeret på contig ved BLASTJUSTERING af EST-sekvens med den tilgængelige PAC-eller BAC-genomiske sekvens.

for at identificere formodede nye udtrykte sekvenser blev 23 PAC-kloner fra den minimale flisebelægning delvist eller fuldstændigt sekventeret. Den genomiske sekvens af disse kloner blev analyseret ved hjælp af niks-programmet., 1998), som tillader samtidig observation af et antal genidentifikationsværktøjer, herunder GRAIL, GENSCAN og BLAST. Otte tidligere ikke-kortlagte Est ‘ er og gener blev identificeret (tabel 3). Seks af disse lå inden for MPD CDR og syv lå inden for MDS CDR. Der blev opnået bevis for, at seks ud af disse otte formodede udtrykte sekvenser repræsenterede bona fide transkriberede gener snarere end forarbejdede pseudogener eller genomiske DNA-forurenende stoffer i EST-databasen. KCNS1 er et gen, der koder for en kaliumspændingsgated kanalunderenhed. Est ‘ er AA053206 / aa053121 blev efterfølgende fundet at være afledt af SGK2-genet (Kobayashi et al., 1999). Justering af cDNA-sekvens til genomisk sekvens viste en ekson / intron-struktur for tre af de resterende seks Est ‘ er (AI312497, aa568401 og aa910031) med splejsningsstedets konsensussekvens til stede ved alle ekson/intron-grænser. I alle tre af disse tilfælde blev tilstedeværelsen af hver ekson bekræftet af ekson forudsigelsesprogrammer såsom GRAIL. Eksistensen af en ekson blev også forudsagt af GRAIL, GENSCAN og Genefinder inden for regionen PAC dJ1108D11, som var tilpasset EST AA993161, hvilket antyder, at denne EST også repræsenterede et transkriberet gen.

sekvensanalyse af PACs indefra den minimale flisebelægningsvej tillod os også at etablere den genomiske struktur af kendte og nye gener i denne region. Tilpasning af RPTPrho cDNA til PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 og dJ269M15 viste, at dette gen spænder over mindst 1,2 Mb. PAC dJ138B7 indeholdt to gener (h-l(3)mbt og SGK2) såvel som 5′-delen af genet svarende til SHGC-36858. Især indeholder H-l (3) mbt-genet 20 eksoner med to formodede alternative endelige eksoner. Analyse af dJ644L1 viste, at det humane MafB-gen består af en enkelt ekson. Analyse af færdig sekvens blev også udført af Sanger Center (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana), og dette kan ses på http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&klasse=genomsekvens.

disse data fastslår tilstedeværelsen af seks gener og yderligere 14 Unkiue Est ‘er inden for den nye MDS/AML CDR og i alt 14 gener med 23 unikke Est’ er inden for den nye MPD CDR (tabel 3). Seks gener og 10 unikke Est ‘er er til stede i overlapningsområdet mellem de to CDR’ er.

Ekspressionsprofilering

myeloproliferative lidelser, myelodysplastiske syndromer og akut myeloid leukæmi antages at skyldes transformation af en multipotent celle i det hæmatopoietiske stamcellekammer (Bonnet and Dick, 1997; Kralovics og Prchal, 1998). Desuden har det tidligere vist sig, at 20K-deletionen kan opstå i en stamcelle, der er i stand til at give anledning til både myeloide celler og B-celler (Hvid et al., 1994). Disse overvejelser tyder på, at genet eller generne på kromosom 20k, som er inaktiveret i disse sygdomme, sandsynligvis vil blive udtrykt i normale hæmatopoietiske stamceller. Vi bestemte derfor, hvilke af de transkriberede sekvenser der blev udtrykt i knoglemarv og oprensede CD34-positive celler.

revers transkription PCR (RT–PCR) amplifikation blev udført med primere, der repræsenterer hver af de 51 transkriberede sekvens (figur 5). Mindst to uafhængige RT–PCR-amplifikationer blev udført for hver transkriberet sekvens. Primere svarende til en EST (vi-7685) afledt af 3′ UTR af CD34-genet blev anvendt som en positiv kontrol (figur 5). Hvor to eller flere Est ‘ er svarede til den samme transkriberede sekvens, blev det samme resultat opnået for hver EST.

dataene er vist i figur 5, Tabel 3 og 4. Af de 37 udtrykte sekvenser i MPD CDR blev 20 udtrykt i knoglemarvsmononukleære celler. Af disse blev 16 også udtrykt i CD34 positive celler. Inden for MDS / AML CDR blev 11 ud af 20 transkriberede sekvenser udtrykt i knoglemarvsmononukleære celler. Af disse blev otte også udtrykt i CD34 positive celler. Af de 16 transkriberede sekvenser, der ligger inden for overlapningsområdet mellem MPD og MDS/AML CDR ‘ er, blev otte udtrykt i knoglemarvsceller, hvoraf fem også blev udtrykt i CD34-positive celler. Disse fem transkriberede sekvenser repræsenterer derfor primære kandidatgener, da de ligger inden for både MPD og MDS/AML CDR ‘ er og udtrykkes inden for det hæmatopoietiske stamcellekammer. De omfatter to ukendte gener svarende til ESTs SHGC-36858 og vi-12515 samt tre gener, SFRS6, h-L(3)mbt og MYBL2.