Kimærer

hvad du vil give Del i

• et kontonummer.
• en mycoplasma-fri ES-cellelinie med 40 kromosomer.

hvad vi vil gøre

• vi injicerer cirka 50 blastocyster pr. Dette skulle resultere i 10 mus født. Tre af musene forventes at være stærke mandlige kimærer. Vi har dokumenteret succes.
• vi vil huse musene indtil fravænning (tre uger efter fødslen).

hvad du vil give Del II

• du vil huse de fravænnede mus.

omkostninger

• $3.300 pr.129 cellelinje og omkostningerne til donorhunner; $4.950 pr. cellelinje og omkostningerne til donorhunner til andre genetiske baggrunde.
• lokale ordrer vil blive opkrævet yderligere $200 for pakning og transport af mus. Ikke-lokale ordrer vil blive opkrævet $200 og omkostningerne ved transport.

lovgivningsmæssig overholdelse

• efterforskere har brug for en iacuc-protokol fra deres institution for at modtage mus fra kernen. Iacuc-protokoller skal angive brugen af sagen transgen kerne. Undersøgere har ikke brug for en egen IBC-protokol, normalt: gennemgangen af rekombinant DNA hos dyr vil blive udført på de oplysninger, der indsendes via online bestilling af den transgene kerne, og vil blive føjet til kernens IBC-protokol som en ændring, hvis den godkendes. Du kan blive kontaktet af IBC for yderligere oplysninger som en del af rDNA gennemgang efter indsendelse af ordren. IBC-godkendelse er påkrævet inden påbegyndelse af injektioner.

anerkendelser

• vi beder dig om at anerkende sagen transgen og Målretningsfacilitet i seminarer og publikationer.

tidslinje

• fra injektionsdatoen for celler vil det være mindst 6 uger, før vi kan levere mus til dig (næsten 3 uger til drægtighed og mindst 3 ugers postnatal vækst før fravænning). Det vil vare yderligere 6 uger, før de mandlige kimærer vil være gamle nok til at opdrætte, og mindst en anden 6 uger før du vil have fravænnet afkom til genotype for at teste for kimlinjetransmission-i alt 4.5 måneder fra injektion til test for kimlinjetransmission.
• den aktuelle (3/25/21) forventede tid mellem ordreafgivelse og ES-celleinjektion er 8 uger. I løbet af de 8 uger før injektion gennemgås kimæreanmodningen af IBC ‘ s rDNA-udvalg, ES-cellerne optøes og dyrkes, og mus bestilles og modtages.

succesrate ved generering af Kimære mus

kernen genererer i gennemsnit ca.5 kimærer pr. cellelinie.

Kom godt i gang
sandsynligheden for kimlinjetransmission af en målrettet mutation øges med antallet af tilgængelige uafhængige ES-cellelinjer. I gennemsnit vil omkring to tredjedele til tre fjerdedele af ES-cellelinjer på den 129 genetiske baggrund gå kimlinie. For ES-cellelinjer på C57-baggrunden vil et gennemsnit på kun halvdelen til to tredjedele af linjerne gå kimlinie. Derfor, hvis du køber målrettede ES-cellelinjer fra et offentligt lager, anbefaler vi, at du køber 3 eller flere korrekt målrettede linjer på 129-baggrunden og 4 eller flere linjer på C57-baggrunden. Ligeledes Bestil 2 eller flere injektioner til 129 linjer og 3 eller flere til C57 linjer. For generering af vævsspecifikke knockouts med betingede alleler i ES-celler fra EUCOMM, se vores primer.

Ofte Stillede Spørgsmål

Hvad er kimærer?
typisk er kimærer konstrueret til at generere mus fra genmålrettede eller genfangede ES-cellelinjer. ES-celler injiceret i værtsembryoer giver anledning til mosaikmus kendt som kimærer.
mandlige ES-celler injiceres i useksede blastocyster. Hvis værtsembryoet er kvindeligt, og de mandlige ES-celler fremstiller kimceller, vil kimæren ofte være en frugtbar mand. Værtsembryoner fra en stamme, der ikke konkurrerer for stærkt med ES-cellerne, anvendes, og de to komponenter (ES og værtsembryo) er genetisk mærket med pelsfarvegener, så es-cellernes Bidrag til dyret let kan bestemmes. Hvis andelen af ES-celleafstødninger i dyrets frakke er høj, er sandsynligheden for, at ES-celler er repræsenteret i kønsceller, også høj, da ES-celler blandes grundigt med værtsceller tidligt i embryogenese. Frakkefarvemærkningssystemet gør det også muligt med passende kryds at bestemme, om Kimærernes afkom er fra ES-cellekomponenten eller værtsembryokomponenten.
129 ES-celler giver anledning til brun pelsfarve, fordi de er A/A (vildtype Agouti), og C57BL/6J værtsembryoer giver anledning til sort pelsfarve, fordi de er A/A (recessiv nonagouti). ES-cellerne er fra 129-stammen af mus; værtsembryoerne er fra C57BL / 6J-stammen af mus. Hvis disse kimærer opdrættes til A/A-ikke-agouti-mus (for eksempel C57BL/6J, skal ethvert brunt afkom (a / a) være opstået fra ES-celleafledte kønsceller, og 50% af det brune afkom forventes at bære knockout-allelen. Alternativt kan transmissionen af mutationen analyseres direkte ved PCR eller Southern blot assays af væv fra afkom.
hvis ES-cellerne er fra C57BL / 6J-stammen (a/a, Tyr/Tyr og sort), vil værtsembryoet være albino C57BL/6J (a/a, Tyrc-2j / Tyrc2-J og hvid). Opdræt af sådanne kimærer til albino C57BL / 6J kan generere sorte afkom (a/a, Tyr/Tyrc-2j) fra ES-cellekomponenten, hvoraf 50% skal bære mutationen, og hvide afkom (a/a, Tyrc-2j / Tyrc-2j) fra værtsembryokomponenten.

de mandlige kimærer, som sandsynligvis vil transmittere den målrettede mutation, kan identificeres ved copulatorisk pluggenotypebestemmelse.

kimærer til andre anvendelser
vi laver også aggregeringskimærer og diploidtetraploide kimærer. To præimplantationsembryoner fra to forskellige musstammer kombineres for at danne en aggregeringskimera. Denne teknologi kan bruges til at generere genetiske mosaikembryoner til analyse af autonomi og nonautonomy af genhandling og andre eksperimentelle mål. I diploidtetraploide kimærer giver den tetraploide komponent stort set anledning til meget af den embryo-afledte placenta og den diploide komponent til embryoet. Denne type kimær kan bruges til at bestemme, om der kræves et gen i placenta eller embryo.

Hvorfor er mine mus sjove farver?
nogle ES-cellelinjer er heterosygøse for frakkefarvealleler, der kun afslører sig i efterfølgende generationer. R1 129 es-cellerne, vi bruger, er heterosygøse ved albino locus, der bærer en kopi af chinchilla allel af albino (cch, også betegnet Tyrc-ch) og er heterosygøse ved Pink-eyed fortynding locus (p). Avl afkom nedstammer fra R1 ES celler til hinanden kan give anledning til mus, som er sorte, forskellige nuancer af grå, forskellige nuancer af brun, eller gul, afhængigt af sortiment af pels farve alleler.

Hvad kan der gøres for at sikre kimlinjetransmission?
Kimlinjetransmission maksimeres med ES-celler, der har brugt et minimum af tid i kultur, der har et normalt komplement af kromosomer, og som er fri for gær, bakterier og mycoplasma. Målret mod en cellelinje, som du ved, overføres under dine forhold på din institution. Brug en forældrecellelinje, der er ved det laveste tilgængelige passagenummer (helst mindre end passagenummer 16). Minimer den tid, den målrettede linje dyrkes. Kontroller, at målrettede cellelinjer har det normale antal kromosomer. Test din cellelinje for mycoplasma. Nogle cellelinjer transmitterer ikke, selv når alle disse parametre er til din fordel. Selv under optimale forhold overføres kun to tredjedele af målrettede ES-cellelinjer gennem kimlinjen. Start derfor med mindst tre uafhængige målrettede cellelinjer for at sikre transmission.

jeg har svage kimærer/kvindelige kimærer. Vil de overføre knockout?
både svage kimærer og kvindelige kimærer kan overføre mutante alleler, skønt sjældent. Mandlige kimærer, der sandsynligvis transmitterer den målrettede mutation, kan identificeres ved copulatory plug genotypebestemmelse. Kun omkring 10% af kvindelige kimærer transmitterer ES-cellegenomet, når de gør det, er det kun i de første par kuld, og mange af deres mandlige afkom har kønskromosomaneuploidier, der gør dem ufrugtbare (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

Hvorfor døde mine stærkeste kimærer?
dødeligheden kan stige med andelen af dyret, der kommer fra ES-Celler, selv for de bedste cellelinjer. Denne dødelighed skyldes i vid udstrækning epigenetiske afvigelser, der opstod i kulturen. De epigenetiske afvigelser menes at blive korrigeret ved efterfølgende opdræt af overlevende mus og ville adskille sig tilfældigt væk fra det målrettede locus, selvom de ikke var det.

hvilken stamme af mus opdrætter jeg mine mutanter til?
for at minimere genetisk variation så hurtigt som muligt opdrættes kimærerne til samme baggrund som ES-cellerne. Hvis ES-cellerne var 129, opdræt kimærerne til 129 mus, og din mutation vil være helt på den 129 indavlede baggrund i et trin. Den mest almindelige indavlede baggrund for genetiske undersøgelser er C57BL/6-stammen. Hvis dine ES-celler er C57BL/6, skal du krydse dine kimærer til C57BL/6J-mus. Hvis du ønsker at ændre baggrunden, er standarden at gøre 9 serielle kryds til den indavlede stamme af valg (ca.2,5 år). Begrundelsen for de 9 generationer forklares her af Lee Silver. Alternativt kræves ca.halvdelen af antallet af generationer af markørassisteret backcross eller hastighedskongenik.For maksimal reproduktion skal du krydse dine mus på en udbrudt stamme som CD1. CD1-mus blev afledt af svenske mus, har en høj grad af genetisk variation og blev udvalgt til robust reproduktion.

ES-celler med betingede alleler fra EUCOMM
hver cellelinje fra EUCOMM kræver, at du udfylder en Materialeoverførselsaftale. Start denne proces så tidligt som muligt.
generationstiden for mus og antallet af kryds, der er nødvendige for at generere de eksperimentelle mus, kombineres i en længere periode, hvilket er overraskende for dem, der ikke er vant til musegenetik, så planlæg fremad. Generationstiden for mus (tiden fra seksuelt moden voksen til seksuelt moden afkom) er omkring 3 måneder.
EUCOMM-betingede alleler har typisk en FRT-flankeret kassette (en” Frt-ed ” kassette). Kassetten har en splejsningsacceptor, der omdirigerer stort set al splejsning i kassetten, hvilket gør allelen til en tab af funktionsmutation i denne konfiguration. For at generere den betingede allel skal den Frt-flankerede kassette fjernes ved at krydse til flpe-ekspressive mus. Flpe / Frt-systemet er sammenligneligt, men adskiller sig fra Cre/lop-systemet.
vi injicerer ES-cellerne i værtsembryoer for at fremstille kimære mus. Derfra vil du opdrætte musene for at generere mus, der bærer mutationen (kimlinjetransmission). Denne grundlæggergeneration af mus kan krydses til mus, der udtrykker Flpe for at fjerne Frt-ed-kassetten og generere den betingede allel. Derefter skal du gøre flere flere kryds for at generere de eksperimentelle mus.

1. fra ES-celleinjektion til voksne seksuelt modne kimærer er generationstiden for mus (3 måneder).
2. kimærerne opdrættes til vildtype mus for at etablere mutanten i kimlinjen (3 måneder).
3. de heterosygøse FRTD-betingede mus krydses til Flpe, der udtrykker homosygoter. Dette genererer Flpe / o, FRTD betinget / + afkom. (3 måneder)
4. flpe/o, FRTD betingede/+ mus krydses til vildtype for at fastslå den udskårne allel i kimlinjen og opdrætte Flpe væk, og udskæring verificeres molekylært i disse betingede/+ mus (3 måneder).
5. de betingede/+ mus opdrættes derefter til hinanden for at fremstille homosygøse betingede allelmus (3 måneder).
6. de betingede/betingede mus opdrættes til vævsspecifik-Cre/vævsspecifik-Cre, null/+ mus for at gøre det eksperimentelle vævsspecifikke-Cre/o, betingede/null mus og kontrolvævsspecifik-Cre/o, betinget/+ mus.

derudover skal fple -, null -, Cre-musene opnås, de vævsspecifikke-Cre/vævsspecifikke-Cre, null/+ – mus skal opdrættes.
den betingede allel skal også analyseres for at bestemme, om den er vildtype i funktion før udskæring med Cre og null efter udskæring med Cre. For at afgøre, om den betingede allel er vildtype i funktion før udskæring, bør betingede/betingede og betingede/null mutanter undersøges for at afgøre, om deres fænotype er den samme som henholdsvis +/+ og null/+ musene. For at afgøre, om den Cre-udskårne betingede er en nul-allel, krydses den betingede til en kimlinie-CRE-mus, og de udskårne betingede krydses for at teste, om fænotypen af den udskårne betingede/udskårne betingede er den samme som nul/nul og/eller at der ikke fremstilles noget protein fra den udskårne betingede allel.
en reporter af Cre-aktivitet som RosaReporter, eller mere ideelt, der viser direkte, at proteinet af interesse er fraværende fra målcellerne ved immunofluorescens, er en vigtig kontrol. RosaReporter genererer permanent beta-galactosidaseekspression i alle celler, der blev udsat for Cre.
overdreven CRE-ekspression kan føre til kromosombrud, som kan forårsage fænotyper, der ikke er relateret til funktionen af den betingede allel. Derfor er søskendemus, der udtrykker Cre, men bevarer en vis genfunktion (for eksempel betinget/+) en vigtig kontrol.