når du tænker på at adskille proteiner, tænker du på at adskille dem ved hjælp af en gel? Specifikt ved hjælp af SDS-side? Hvis du svarede “ja”, er det med god grund. SDS-PAGE er allestedsnærværende i molekylærbiologiske laboratorier, fordi det er godt at adskille proteiner. SDS-PAGE tager dog meget tid og er arbejdskrævende. Så lad os udvide din værktøjskasse og se på en anden måde at adskille proteiner på: kapillær gelelektroforese.
kapillær gelelektroforese (CGE) alias kapillær sigteelektroforese alias.a. SDS-kapillær gelelektroforese adskiller proteiner i en gel via søjler fyldt med et adskillelsesmedium.
udstyrskrav
i kapillærgelelektroforese vandrer dine analytter (de proteiner, du vil studere) gennem en elektrolytisk opløsning gennem kapillærer ved hjælp af trækkraften i et elektrisk felt – ikke i modsætning til den mere velkendte SDS-side. For at udføre CGE du har brug for: en prøve hætteglas, kilde og destination hætteglas, sigtning matrice, kapillær kolonne, en on-kolonne detektor, en data output og håndtering enhed og en højspænding strømforsyning.
protokol i korte træk
i et CGE-eksperiment starter din prøve ved kildehætteglasset og går mod destinationshætteglasset. Her er protokollen i korte træk:
Trin 1: kilden og destinationerne hætteglas såvel som kapillæren, der forbinder dem, er fyldt med en elektrolytisk opløsning, og prøven indføres i kapillæren.
Trin 2: Når det elektriske felt er påført, migrerer analytterne fra kildehættesiden til destinationshættesiden.
Trin 3: on-kolonne detektoren (ikke overraskende) giver mulighed for on-kolonne detektion. Detektoren sender data til en dataudgang og håndteringsenhed, såsom en computer.
Trin 4: disse data vises derefter som et elektroferogram. Dine analytter læses som toppe af forskellige retentionstider.
for at finde flere detaljer om, hvordan dette fungerer, besøg UC Davis’ nyttige materiale.
mere om matricen
din sigtningsmatrice kan være sammensat af et antal polymeriserede materialer, herunder tværbundet polyacrylamid, dekstran og poly(ethylenglycol eller ethylenilte). Dine kolonner er normalt lavet af udskiftelige sigtepolymerer. Det er så op til dig, hvis du laver dine egne kolonner eller køber dem. Beckman Coulter, Agilent Tech og Bio-Rad Laboratories sælger sigtesæt, men ved, at disse kræver, at du også bruger deres CGE-instrumenter.
hvorfor skal du bruge CGE
nu har du hørt om, hvad CGE er, hvorfor skal du bruge det?
- det har en kortere driftstider. At køre en CGE tager 10-100 gange mindre tid at gennemføre end pladegelelektroforese.
- der er færre trin i et CGE-eksperiment end i et SDS-SIDEEKSPERIMENT. Dette skyldes, at slutresultaterne af CGE-eksperimentet gives af en computer, der er tilsluttet apparatet.
- CGE er også bedre egnet til små proteiner end traditionelle SDS-side.
- du kan analysere dine proteiner i realtid med CGE.
- CGE-udstyr kan bruges gentagne gange, ikke nødvendigt at fremstille uendelige geler.
- endelig er meget af processen automatisk. Når du har tilføjet din prøve, er du færdig! Dette betyder, at du ikke behøver at overvåge processen, som om du laver en gel eller bringer den til specielt detekteringsudstyr, så snart gelen er kørt.
hvorfor du ikke skal bruge CGE
nå, sandheden skal fortælles selvom CGE har eksisteret i sin nuværende form i over et årti, og der er gjort mange tekniske fremskridt, lider CGE stadig af reproducerbarhedsproblemer. Et andet problem er, at CGE-separationer udføres i serie. Dette betyder med CGE, at du ikke nemt kan sammenligne baner. Endelig, når det kommer til 2D geler, kan CGE bare ikke konkurrere med traditionel 2D-adskillelse.
sammenfattende, mens nogle forskere stolt udbryder brugen af CGE-teknologi, er der stadig en række problemer med det. Men afskedig ikke CGE endnu! Det seneste skub på dette område er mikrochip CGE, som viser meget løfte om højhastighedsproteinanalyse. Så næste gang du tænker på protein adskillelse glem ikke CGE.
har du prøvet CGE? Hvordan kan du lide det i forhold til SDS-PAGE?