antistoffer
kanin IgG (Sigma) konjugeret til Dynabeads blev brugt mod TAP-taggede stammer, hvor TAP-tag indeholdende Protein A var målet. Millipore 07-729 antistof blev anvendt mod k562-prøver rettet mod CTCF.
TN5 rensning
en brugerdefineret konstruktion af Tn5 E54K E110K P242A L372P14 i en pet-45B( + ) vektor blev bestilt (GenScript) til at udtrykke hyperaktiv Tn5 med en N-terminal His6-tag. Plasmidet er tilgængeligt på Addgene (Addgene ID: 112112). Bl21 (DE3) kompetente E. coli-celler (Ny England Biolabs) blev transformeret, og en enkelt koloni blev dyrket ved 37 liter C til en OD600 på 0,4 i 500 ml LB + 50 liter/ml ampicillin + 30 liter/ml chloramphenicol. Celler blev overført til en 25 liter C-inkubator og induceret med 0,5 mM isopropyl-L-D-galactopyranosid i 4 timer. cellerne blev opsamlet ved centrifugering, vasket en gang med ST-Buffer, og cellepelleten blev flashfrosset i flydende nitrogen.
Tn5 blev renset som tidligere beskrevet10, med få modifikationer. Kort fortalt blev cellerne resuspenderet i 10 volumener (ml/g) af 100 Buffer (20 mm Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,1% Triton-100) indeholdende KPI og 100 liter phenylmethylsulfonylfluorid og lyseret ved inkubation med lysosym (Sigma; 1 mg / 1 g cellepellet) ved stuetemperatur i 30 minutter. Lysatet blev centrifugeret ved 20.000 liter g i 20 minutter ved 4 liter C, og supernatanten blev udfældet med 0,25% polyethylenimin (Sigma) og centrifugeret ved 10.000 liter g i 15 minutter. Supernatanten blev derefter udfældet med 47% mætning ammoniumsulfat (0.28 g/ml) over en inkubation på 30 minutter og derefter centrifugeret ved 20.000 liter g i 15 minutter.
pelleten blev derefter resuspenderet i 50 ml Nikkelaffinitetsbelastningsbuffer (50 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glycerol) og lastet på en HisTrap HP-søjle (GE Healthcare; 5 ml) ved 1,5 ml/min ækvilibreret med den samme buffer. Søjlen blev sekventielt vasket med vaskebuffer i (50 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidasol, 20% glycerol), vaskebuffer II (50 mM kaliumphosphat, pH 7.4.500 mM KCl, 50 mM imidasol, 20% glycerol), og derefter blev Tn5 elueret med Nikkelaffinitetselutionbuffer (50 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 500 mM KCl, 500 mM imidasol, 20% glycerol) ved 2 ml/min. Eluatet blev fortyndet til 300 mM KCl med Fortyndingsbuffer (50 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 20% glycerol), og det endelige volumen blev justeret til 50 ml med TEGKS300 Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,1% Triton-100).
dernæst blev prøven indlæst på en HiTrap Heparin HP kolonne (GE Healthcare; 1 ml) ækvilibreret med TEGKS300 ved 1 ml/min. Efter vask med 5 søjlevolumener buffer blev en 10 ml lineær (300 mM til 1,2 M) NaCl-gradient kørt for at eluere. Tn5 elueres fra søjlen ved ca. 600 mm NaCl. Fraktioner indeholdende den primære elueringstoppe blev kombineret (3,5 ml) og dialyseret natten over mod TEGKS300-Buffer indeholdende 30% glycerol og derefter opbevaret ved -80 liter C.
gærchromatinpræparat
TAP-mærkede Saccharomyces cerevisiae-stammer (åbne biosystemer) blev dyrket i 500 ml gærpeptondestrosmedier til en OD600 = 0,8 ved 25 liter C. Celler blev tværbundet med formaldehyd ved en slutkoncentration på 1% i 15 minutter ved stuetemperatur og standset med en slutkoncentration på 125 mM glycin i 5 minutter. Celler blev opsamlet ved centrifugering og vasket i 1 ml ST-Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) ved 4 liter C og opdelt i to alikvoter. Cellerne blev pelleteret igen, supernatanten blev fjernet, og pelleten blev flashfrosset.
en 250 ml kultur alikvot blev lyseret i 750 liter fa Lysis Buffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% natriumdioksicholat og CPI) og 1 ml volumen på 0,5 mm sirconia/silica perler ved perlebeslag i en Mini-Beadbeater-96 maskine (Biospec) i tre cyklusser på 3 Min on/5 min off cyklusser (prøver blev holdt på is under off cyklus). Lysatet blev overført til et nyt rør og mikrocentrifugeret ved maksimal hastighed i 3 minutter ved 4 liter C for at pille kromatinet. Supernatanten blev kasseret, og pelleten blev resuspenderet i 750 liter fa Lysis Buffer suppleret med 0,1% SDS og overført til et 15 ml polystyren konisk rør. Prøven blev derefter sonikeret i en Bioruptor (Diagenode) i 15 cyklusser med 30 s tænd/sluk-intervaller for at opnå DNA-fragmenter 100 til 500 bp i størrelse. Et ChIP – ekso-assay behandlede ækvivalenten af 50 ml cellekultur (~6 liter 108 celler). Dette repræsenterer et passende beløb snarere end et minimumsbeløb, der er nødvendigt.
k562-kromatinpræparat
humane kroniske myelogene leukæmiceller (K562, ATCC) blev opretholdt mellem 1 liter 105 og 1 liter 106 celle/ml i DMEM-medier suppleret med 10% føtal bovint serum ved 37 liter C med 5% CO2. Celler blev vasket med PBS (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl og 2,7 mM KCl), derefter tværbundet med formaldehyd ved en endelig koncentration på 1% i 10 minutter ved stuetemperatur og slukket med en endelig koncentration på 125 mM glycin i 5 minutter. Supernatanten blev fjernet, og cellerne blev resuspenderet i 1 ml PBS for at vaske. Celler blev alikteret til at indeholde 100 millioner celler, centrifugeret, supernatanten blev fjernet, og pelleten blev flashfrosset.
en 100 millioner celleakkvot (til brug i flere ChIPs) blev lyseret i 500 liter (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40 og komplet proteasehæmmer (CPI, Roche)) ved at inkubere på is i 10 minutter. Lysatet blev mikrocentrifugeret ved 2500 o / min i 5 minutter ved 4 liter C. supernatanten blev fjernet, pelleten blev resuspenderet i 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS og CPI) og inkuberet på is i 10 minutter for at lyse kernerne. Prøven blev fortyndet med 600 liter immunopræcipitationsfortyndingsbuffer (IP-Fortyndingsbuffer: 20 mm Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-100 og CPI) til en slutkoncentration på (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-100, 0.2% SDS og CPI) og sonikeret med en Bioruptor (Diagenode) i 10 cyklusser med 30 s tænd/sluk-intervaller for at opnå DNA-fragmenter 100 til 500 bp i størrelse.
musevævspræparat
16 uger gammel voksen hanmus hjerne, lunge, lever og nyrevæv blev generøst leveret af Dr. Yanming Vang Musevæv blev behandlet ved 100 mg, og kromatin blev genereret som tidligere beskrevet21 med mindre ændringer. Kort sagt blev 100 mg musevæv hakket i stykker på is, fikseret med 1% formaldehyd i 10 minutter og derefter slukket med en endelig koncentration på 125 mM glycin i 5 minutter. Cellerne blev spundet, vasket med PBS og derefter resuspenderet i 1 mL kold Farnham cellelysbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton H-100 og CPI). Celler blev derefter inkuberet på en rototorke i 20 minutter ved 4 C. isolerede kerner blev isoleret ved spundet ned og resuspenderet i RIPA nuklear lysis buffer (1 liter PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoksicholat, 0,5% SDS og CPI). Kerner blev derefter sonikeret med en Bioruptor (Diagenode) i 10 cyklusser med 30 s tænd/sluk-intervaller for at generere DNA i størrelsesområdet 100-500 bp. Levercelletal blev estimeret som tidligere beskrevet22 ved anvendelse af en konverteringsfaktor på 1 mg vævsvådvægt er lig med ~250.000 celler.
Kromatinimmunudfældning
en 50 ml dyrkningsækvivalent af gær eller 10 millioner celleækvivalent af K562-kromatin blev fortyndet til 200 liter med IP-Fortyndingsbuffer og inkuberet natten over ved 4 liter C med det passende antistof. En 10 liter sengevolumen af IgG-Dynabeads blev tilsat til gærprøverne; og 3 liter anti-CTCF-antistof med en 10 liter opslæmningsækvivalent af Protein A Mag Sepharose (GE Healthcare) blev tilsat til k562-prøverne.
ChIP-ekso 1.1
ChIP-ekso 1.1 blev udført som tidligere beskrevet7,8,23. Kort sagt blev følgende trin udført med immunopræcipiteret kromatin stadig på harpiksen med flere saltvasker mellem hvert trin: T4-DNA-polymeraseendepolering, T4-polynukleotidkinase, klenufragment A-tailing, T4-DNA-ligase-medieret read_2-adapterligering, phi29-DNA-polymeraseudfyldning, anden T4-polynukleotidkinase, Lambda-eksonukleasefordøjelse og RecJf-eksonukleasefordøjelse. Efter omvendt tværbindings-og Proteinase K-behandling natten over blev følgende trin udført i opløsning: phi29-primerforlængelse, andet klenufragment A-tailing, T4 DNA-ligase-medieret read_1-adapterligering og PCR.
ChIP-ekso 3.0 og 3.1 (tagmenteringsbaseret version)
efter immunudfældning blev følgende trin udført på harpiksen. For at samle Transposasen blev Tn5 inkuberet i en blanding af 10 liter Transposase indeholdende følgende komponenter og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur: 12,5 liter TN5, 50% glycerol og 7,5 liter adapter (næste 2/ME comp). Se supplerende tabel 1 For oligonukleotidsekvenser anvendt i denne undersøgelse.
Chipmaterialet på harpiks blev vasket sekventielt med FA Lysis Buffer, NaCl Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-100, 0.1% Natriumdeksicholat), LiCl-Buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeksicholat) og 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ved 4 liter C.
tagmenteringsreaktionen (30 liter) indeholdende: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% dimethylformamid og 1 en blanding af oprensning fra trin 1 (slutkoncentration: 1,25 liter TN5, 5% glycerol, 750 nm adapter) blev inkuberet i 30 minutter ved 37 liter C. efter inkubation blev harpiksen vasket to gange med Guanidinhydrochloridbuffer (50 mm tris-HCL, pH 7,5, 500 mm Guanidinhydrochlorid, 2 mm EDTA, 1% Triton-100, 0.1% natrium deoxycholate) i 5 minutter ved 37 °C, derefter en gang med LiCl Buffer og 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C.
fyld-i reaktion (30 µl) indeholder: 10 U phi29-polymerase (NEB), 1 × phi29 reaction buffer (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA, og 165 µM dntp ‘ er blev inkuberet i 20 min ved 30 °C, derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ved 4 °C. kinase reaktionen (30 µl) indeholder: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 DNA-Ligase Buffer (NEB), og 2 × BSA blev inkuberet i 15 min ved 37 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C. λ exonuclease fordøjelse (100 µl) indeholder: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reaction buffer (NEB), 0.1% Triton-X-100, og 5% DMSO var inkuberes i 30 minutter ved 37 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C. RecJf exonuclease fordøjelse (100 µl) indeholder: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton-X-100, og 5% DMSO var inkuberes i 30 minutter ved 37 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C.
– DNA var elueres fra harpiks, og omvendt cross-linking og Proteinase K behandling blev udført (40 µl) indeholder: 30 mg Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl og 0,5% SDS inkuberet i 16 timer ved 65 liter C. supernatanten blev derefter overført til et nyt rør og oprenset med Agencourt AMPure magnetiske perler (Beckman Coulter) efter producentens anvisninger og ved hjælp af 1,8 liter volumen Ampuropslæmning tilsat til DNA-volumenet (72 liter).Prøven blev elueret fra Ampurperlerne i 10 liter vand, og de følgende trin blev udført i opløsning.
Adapterligering (version 3.0) : til primerforlængelsesreaktionen (samlet reaktionsvolumen 20 liter); til resuspenderet prøve blev tilføjet 1 × phi29 reaction buffer, 2 × BSA, 100 µM dntp ‘ er, og 0,5 µM MIG sekvens oligonukleotid (i alt 9 µl) og inkuberes i 5 minutter ved 95 °C, derefter 10 min ved 45 °C til at tillade oligo tid til at anneale. Prøven var flyttet til 30 °C inden tilsætning af 10 U phi29-polymerase (1 µl) og kommer op i 20 min ved 30 °C, derefter i 10 minutter ved 65 °C for at inaktivere, og flyttet til 37 °C.
For A-hale reaktion (samlede reaktion volumen 30 µl); til primer extension reaktion blev tilføjet 10 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (i alt 10 µl) og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C, derefter i 20 min ved 75 °C for at inaktivere, og flyttet til 25 °C. i den anden adapter ligation reaktion (samlede reaktion volumen 40 µl); til En-hale reaktion blev tilføjet til 2.000 U T4 DNA-ligase (enzymatics), 1 × NEBNext Hurtig Ligation Buffer (NEB), 375 nM-adapter (ExA1-58/13) og inkuberes i 1 time ved 25 °C.
Skinne ligering (version 3.1): for adapter ligering (40 µl); til det resuspenderede DNA blev der tilsat 1.200 U T4 DNA-ligase, 1 liter T4 DNA-Ligasebuffer, 375 nM adapter (Eksa1-58/Eksa1-SSL_N5) og inkuberet i 1 time ved 25 liter C.
både version 3.0 og 3.1: ligeringsreaktionen blev derefter oprenset med Ampurperler og resuspenderet i 15 liter vand. Prøven blev derefter forstærket via PCR. Til PCR-amplifikation (total reaktionsvolumen 40 liter); til det resuspenderede DNA blev der tilsat 2 U Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 liter phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 liter dNTPs, 500 nM hver primer (P1.18 cyklusser (20 s ved 98 liter C denaturering, 1 min ved 52 liter C annealing og 1 min ved 72 liter C forlængelse). En fjerdedel af reaktionen blev amplificeret i yderligere seks cyklusser (24 i alt), og tilstedeværelsen af biblioteker blev bestemt ved elektroforese på en 2% agarosegel.
størrelsesvalg: 200-500 BP PCR-produkter blev geloprenset fra en 2% agarosegel under anvendelse af Gelekstraktionssæt.
ChIP-ekso 4.0 og 4.1 (enkeltstrengede DNA-ligeringsversioner)
efter immunudfældning blev følgende trin udført på harpiksen. ChIP materiale på harpiks blev vasket sekventielt med FA Lysis Buffer, NaCl Buffer, LiCl Buffer, og 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C. slutningen reparation reaktion (50 µl) indeholder: 7.5 U T4 DNA-polymerase (NEB), 2.5 U DNA-Polymerase jeg (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 DNA-Ligase Buffer, og 390 µM dntp ‘ er var inkuberes i 30 min på 12 °C, og derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ved 4 °C. λ exonuclease fordøjelse (100 µl)indeholder: 20 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reaction buffer, 0.1% Triton-X-100, og 5% DMSO var inkuberes i 30 minutter ved 37 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ved 4 °C. RecJf exonuclease fordøjelse (100 µl)indeholder: 75 U RecJf exonuclease, 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton-X-100, og 5% DMSO-swas inkuberes i 30 minutter ved 37 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C.
Første adapter til ligering: ssDNA ligering (version 4.0, 40 µl): for adapterion ligation 1200 U T4 DNA-ligase, 1 × T4 DNA-Ligase Buffer, og 375 nM single-strand-adapter (ExA1-58-N5) var der inkuberes i 1 time ved 25 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C.
Skinne ligering (version 4.1, 40 µl): 1200 U T4 DNA-ligase, 1 × T4 DNA-Ligase Buffer, og 375 nM-adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) var der inkuberes i 1 time ved 25 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C.
Begge version 4.0 og 4.1: DNA var elueres fra harpiks, og omvendt cross-linking og Proteinase K behandling blev udført (40 µl) indeholder: 30 mg Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, og 0,5% SDS inkuberes i 16 timer ved 65 °C.
supernatanten blev derefter overført til et nyt rør og oprenset med Agencourt AMPure magnetiske perler (Beckman Coulter) efter producentens anvisninger (1,8 liter volumen). Prøven blev elueret fra Ampurperlerne i 20 liter vand, og de følgende trin blev udført i opløsning.
anden adapterligation: ssDNA-ligering (version 4.0, samlet reaktionsvolumen 40 liter): til det resuspenderede DNA blev der tilsat 1200 U T4 DNA-ligase, 1 liter T4 DNA – Ligasebuffer, 375 nM adapter (Eksa2.1-N5/Eksa2.1-20) og blev inkuberet i 1 time ved 25 liter C.
Splintadapterligation (version 4.1, total reaktionsvolumen 40 liter): til det resuspenderede DNA blev der tilsat 1200 U T4 DNA-ligase, 1 liter T4 DNA-Ligasebuffer, 375 nM adapter (Eksa1-58/Eksa1-SSL_N5) og blev inkuberet i 1 time ved 25 liter C.
både version 4.0 og 4.1: ligeringsreaktionen blev derefter oprenset med ampurperler (1,8 liter volumen) og opblandes i 15 liter vand. Prøven blev derefter forstærket via PCR. Til PCR-amplifikation (samlet reaktionsvolumen på 40 liter); til det resuspenderede DNA blev der tilsat 2 U Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 liter phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 liter dNTPs, 500 nM hver primer (P1.3 og næste 2-iNN) og amplificeret i 18 cyklusser (20 sekunder ved 98 liter C denaturering, 1 min ved 52 liter C annealing, 1 min ved 72 liter C forlængelse). En fjerdedel af reaktionen blev amplificeret i yderligere seks cyklusser (24 i alt), og tilstedeværelsen af biblioteker blev bestemt ved elektroforese på en 2% agarosegel. Størrelsesvalg: 200 til 500 BP PCR-produkter blev geloprenset fra en 2% agarosegel ved hjælp af Gelekstraktionssæt (Chiagen).
Bemærk: ChIP-eks 4.0/4.1 inkorporeret en universel read_2-adapter, med stregkoden tilføjet senere under PCR med lange primere. Når lange PCR-primere blev brugt i en bibliotekskonstruktion, der involverede fordøjelse af lambda-eksonuklease, LED bibliotekerne af lavt udbytte og høje adapterdimerer. Vi bruger nu kun adaptere i fuld længde og PCR-primere med minimal længde.
ChIP-ekso 5.0
efter immunudfældning blev følgende trin udført på harpiksen. ChIP materiale på harpiks blev vasket sekventielt med FA Lysis Buffer, NaCl Buffer, LiCl Buffer, og 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C. For En-hale reaktion (50 µl) indeholder: 15 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, og 100 µM dATP var inkuberes i 30 minutter ved 37 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C. Den første adapter til ligering og kinase reaktioner (45 µl) indeholder: 1200 U T4 DNA-ligase, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Hurtig Ligation Buffer, og 375 nM-adapter (ExA2_iNN / ExA2B) var der inkuberes i 1 time ved 25 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C. Den fill-in-reaktion (40 µl) indeholder: 10 U phi29 polymerase, 1 × phi29 reaction buffer, 2 × BSA, og 180 µM dntp ‘ er blev inkuberet i 20 min ved 30 °C, derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C. λ exonuclease fordøjelse (50 µl) indeholder: 10 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reaction buffer, 0.1% Triton-X-100, og 5% DMSO var inkuberes i 30 minutter ved 37 °C; derefter vaskes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-ved 4 °C.
– DNA var elueres fra harpiks, og omvendt cross-linking og Proteinase K behandling blev udført (40 µl) indeholder: 30 liter proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl og 0,5% SDS inkuberet i 16 timer ved 65 liter C. supernatanten blev derefter overført til et nyt rør og oprenset med Agencourt AMPure magnetiske perler (Beckman Coulter) efter producentens anvisninger (1,8 liter volumen).Prøven blev elueret fra Ampurperlerne i 20 liter vand, og de følgende trin blev udført i opløsning. Til anden adapterligering (samlet reaktionsvolumen 40 liter): til det resuspenderede DNA blev der tilsat 1200 U T4 DNA-ligase, 1 liter T4 DNA-Ligasebuffer, 375 nM adapter (Eksa1-58/Eksa1-SSL_N5) og blev inkuberet i 1 time ved 25 liter C. ligeringsreaktionen blev derefter oprenset med Ampurperler (1,8 liter volumen) og resuspenderet i 15 liter vand.
prøven blev derefter amplificeret via PCR. Til PCR-amplifikation (samlet reaktionsvolumen 40 liter); til det resuspenderede DNA blev der tilsat 2 U Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 liter phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 liter dNTPs, 500 nM hver primer (P1.3 og P2.1) og forstærket i 18 cyklusser (20 s ved 98 liter C denaturering, 1 min ved 52 liter C annealing, 1 min ved 72 liter C forlængelse). En fjerdedel af reaktionen blev amplificeret i yderligere seks cyklusser (24 i alt), og tilstedeværelsen af biblioteker blev bestemt ved elektroforese på en 2% agarosegel. Størrelsesvalg: 200 til 500 BP PCR-produkter blev geloprenset fra en 2% agarosegel ved hjælp af Gelekstraktionssæt (Chiagen).
Bemærk: Vi har fundet ud af, at anvendelse af en anden metode end gelrensning på dette stadium fører til et uacceptabelt højt niveau af adapterdimerer i den endelige prøve. Gelrensning kan effektivt adskille adapterdimeren (150 BP-fragment) og mindre fragmenter af ChIP-ekso-biblioteket (200 BP-fragment = 150 BP-adaptere + 50 bp-indsats).
DNA-sekventering
high-throughput DNA-sekventering blev udført med en næste SEK 500 i parret sluttilstand, der producerede 2 liter 40 BP læser. Sekvenslæsninger blev efterfølgende justeret til gær (sacCer3) og humane (hg19) genomer ved anvendelse af BVA-mem (v0.7.9 a)24. Justerede læsninger blev filtreret for at fjerne ikke-unikke justeringer og PCR-duplikater. PCR-duplikater blev defineret som sekvenslæsninger med identiske Read_1-og Read_2-sekvenser.
datatilgængelighed
alle sekventeringsfiler og topfiler fra denne undersøgelse er tilgængelige på NCBI genekspression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under tiltrædelsesnumre GSE110681 og GSE114606. Koordinatfiler, scriptparametre og brugerdefineret kode, der bruges til at generere tallene for dette papir, kan hentes fra: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.
alle andre data er tilgængelige fra forfatterne efter rimelig anmodning.