baggrund: kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL) har en klassisk immunophenotype, der består af let kædebegrænsning, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – og CD79b-. Dette adskiller det fra normale B-celler og andre lymfoproliferative lidelser (LPD ‘ er). Antistoffer rettet mod disse antigener er inkluderet i to 8-farvestrømningscytometerpaneler udviklet af eurostrømskonsortiet til oparbejdning af B-celle LPD ‘ er. At kombinere disse antistoffer i et 10-farvepanel ville være mere omkostningseffektivt. Desuden kan nye CLL-terapier inducere dybe remissioner, hvilket skaber et stigende behov for at måle minimal restsygdom (MRD), defineret som at have over 1 resterende leukæmisk celle pr.10.000 leukocytter (10-4). Den nuværende internationale standardiserede tilgang til måling af MRD, der er oprettet af Det Europæiske forskningsinitiativ om CLL (ERIC), bruger et panel af antistoffer rettet mod CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b og CD81. Imidlertid er disse antistof-fluorokromkombinationer forskellige end dem, der anvendes af eurostrøms diagnostiske paneler. Laboratorier, der overvejer at implementere MRD-test, skal således købe antistoffer til 3 forskellige paneler (2 diagnostiske og 1 MRD). Vi udvidede Eurostrøm 8-farvet lymfocytscreeningsrør (LST) til at omfatte CD200 og CD23, således at CLL kan detekteres i et 10-farvet rør på niveauer så lave som 0,01%. Målet med denne undersøgelse var at bestemme de potentielle omkostningsbesparelser ved implementering af dette nye panel og at afgøre, om det er følsomt nok til at opdage MRD.
metoder: vi beregnet antallet af prøver analyseret med vores modificerede 10-farve LST-rør (mLST1, opnået lyofiliseret) fra April 2018 til marts 2019 for at udelukke en LPD og antallet af antistof alikvoter gemt ved hjælp af denne tilgang sammenlignet med standard 2-rør Eurostrømsmetoden. Vi oprettede også en version af ovennævnte panel (mLST2) ved hjælp af flydende antistoffer for at øge generaliserbarheden af vores resultater og erstatte CD38 med CD43 for at se, om denne forbedrede MRD-detektion (se paneler nedenfor). Til MRD-test brugte vi CLL-prøver fra 24 forskellige patienter til at producere 60 MRD-prøver i forskellige koncentrationer af leukæmiske celler. Prøver blev fremstillet ved spiking af CLL-celler i suspensioner af normale leukocytter i omtrentlige koncentrationer på 0,1%, 0,01% og 0,001%. Hver prøve blev alikteret og farvet med de tre paneler: ERIC, mLST1 og mlst2. Data blev indsamlet ved hjælp af en BD FACSCanto II eller en BD FACSAria Fusion og analyseret ved hjælp af BD FACSDiva-programmer. CLL-celler blev identificeret baseret på differentiel ekspression af nøglemarkører, og MRD blev beregnet som antallet af CLL-celler/totale leukocytter. MRD-positivitet blev defineret som 0,01%. Aftalen mellem panelerne blev vurderet ved hjælp af Bland-Altman plot-metoden. Vi har også beregnet den procentvise aftale mellem panelerne for at identificere MRD-positivitet.
resultater: på 1 år blev mLST1 udført på 474 prøver, af disse 220 havde en LPD og 123 (56%) havde en klassisk CLL-fænotype, hvilket undgik behovet for yderligere test. Dette resulterede i nettobesparelser på 476 antistof alikvoter. Til MRD-vurdering var differentiel ekspression af CD5 og CD20 de mest signifikante bidragydere til at skelne CLL fra normale B-celler ved hjælp af mLST1 og mLST2. Vi identificerede et CLL-tilfælde med en atypisk immunophenotype (dim CD5, bright CD20), som viste sig vanskeligt at gate ved hjælp af et mlst-panel. Der var enighed om MRD-resultater opnået med mlst-panelerne og ERIC-panelet. For værdier over kvantificeringsgrænsen var aftalegrænsen på 95% 0,3369-log for ERIC vs mLST1-sammenligningen og 0,3485-log for ERIC vs mLST2-sammenligningen. Variabiliteten i MRD-niveauer mellem panelerne var således mindre end 2 gange størstedelen af tiden, hvilket vi betragtede som klinisk acceptabelt, da MRD måles på en eksponentiel skala. ERIC-panelet og mLST1 havde 88,3% enighed om at skelne MRD-positive versus MRD-negative prøver. Aftalen var på 93,3% mellem ERIC-panelet og mlst2.
konklusioner: Det er muligt at bruge et modificeret 10-farvet lst-panel til både diagnose og MRD-måling af CLL. Fordelene er øget fortrolighed med antistofferne og potentielle omkostningsbesparelser, hvilket gør MRD tilgængelig for flere cytometrilaboratorier. Atypiske CLL-sager uden den sædvanlige CD5-positivitet og dim CD20 er meget vanskelige at porte ved hjælp af et LST-panel. I disse tilfælde er ERIC-panelet klart overlegen, da CD22, CD79b, CD81 og CD43 stadig kan tilvejebringe adskillelse mellem de ondartede og normale lymfocytter.
basinet:BD Biosciences: andet: leverede en betydelig mængde af de antistoffer, der blev brugt i dette projekt uden omkostninger.. Vever: Teva Canada Innovation: Beskæftigelse. Gimmig: BD Biosciences: beskæftigelse. Johnson: Lundbeck: beskæftigelse, Honoraria, Medlemskab af en virksomheds bestyrelse eller rådgivende udvalg, andet: Rejsegebyrer, gaver og andre, forskningsfinansiering; Merck: rådgivning, Honoraria; Roche: rådgivning, beskæftigelse, Honoraria, Medlemskab af en virksomheds bestyrelse eller rådgivende udvalg, andet: rejsegebyrer, gaver og andre, forskningsfinansiering; Abbvie: rådgivning, beskæftigelse, Honoraria, Medlemskab af en virksomheds bestyrelse eller rådgivende udvalg, forskningsfinansiering; BD Biosciences: andet: Forudsat en betydelig del af antistofferne anvendt i dette projekt uden omkostninger.; BMS: rådgivning, Honoraria; Seattle genetik: Honoraria.