Enkeltmutation ved et stærkt konserveret område af chloramphenicolacetyltransferase muliggør produktion af isobutylacetat direkte fra cellulose ved Clostridium thermocellum ved forhøjede temperaturer

bakteriestammer og plasmider

bakteriestammer og plasmider anvendt i denne undersøgelse er angivet som en i tabel 2. Clostridium thermocellum dsm1313 liter hpt (M1354) stamme blev brugt som vært for esterproduktionen ved forhøjede temperaturer. Det skal bemærkes, at deletion af hypoksantinphosphoribosyltransferase gen (HPT, Clo1313_2927) i vildtype DSM1313 tillader genteknologi ved 8-aahypoksanthin (8-Ash) modvalg; denne deletion har ingen kendt negativ effekt på cellevækst og metabolisme . Plasmidet pnv33n, der indeholder CATSa, er termostabil og blev brugt til at udtrykke forskellige katte i C. thermocellum. PET-plasmiderne blev anvendt til molekylær kloning og ekspression i E. coli.

kemikalier og reagenser

alle kemikalier er købt hos Sigma-Aldrich (MO, USA) og/eller Thermo Fisher Scientific (MA, USA), medmindre andet er angivet. Til molekylær kloning blev restriktionssymmer og T4-ligase opnået fra Ny England Biolabs (MA, USA). Phusion Hot Start II DNA-polymerase blev anvendt til polymerasekædereaktion (PCR).

medier og dyrkning

til molekylær kloning og proteinekspression blev E. coli-stammer dyrket i lysogeni bouillon (LB) indeholdende passende antibiotika, medmindre andet er angivet. Til in vivo karakterisering af CATSa i E. coli blev M9 hybridmedium med 20 g/L glucose anvendt. Til C. thermocellum-kultur blev MTC-minimalt medium eller CTFuD-ny-medium anvendt som specificeret i eksperimenterne. Optisk densitet (OD) blev målt ved et spektrofotometer ved 600 nm bølgelængde (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Multiple sekvensjusteringsanalyse

Multiple sekvensjustering (MSA) analyse blev udført ved hjælp af MEGA7 . Proteinsekvenser blev justeret af Klustalv og visualiseret af ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) . Nøglefunktionerne i proteinstrukturer af 3U9F, 4cla og 2ksat blev ekstraheret fra henholdsvis CAT_SALTI, CAT3_ECOLIKS og CAT4_PSEAE.

molekylær modellering og docking simuleringer

tredimensionelle (3D) strukturer

3D-strukturen af CATSa og alkoholer af interesse blev først genereret ved hjælp af henholdsvis Moe ‘s Model og’ Builder ‘ -værktøjerne (Molecular Operating Environment programmel, version 2019.01). 3D-strukturen af det dobbelte substratbegrænsede CATSa-kompleks (dvs.acetyl–CoA–isobutanol–CATSa) blev opnået ved ekstraktion af en isobutanol fra isobutanol-CATSa–komplekset og derefter tilsætning til acetyl-CoA-CATSa-komplekset. Alle strukturer blev udarbejdet af Moe’ Hurtigprep ‘ – værktøjet med standardparametre og yderligere optimeret ved energiminimering med Amber10:EHT-kraftfeltet.

Dockingsimulering

for at udføre dockingsimuleringer blev den potentielle bindingslomme søgt ved hjælp af Moe ‘Site Finder’ – værktøjet. Det bedst scorede sted, i overensstemmelse med de rapporterede katalytiske steder , blev udvalgt til yderligere undersøgelser. Docking simuleringer blev udført som tidligere beskrevet . Kort fortalt blev acetyl-CoA og hver alkohol docket ved hjælp af den inducerede fit-protokol med Triangle Matcher-placeringsmetoden og London-scoringsfunktionen. Efter dockingsimuleringerne blev den bedst scorede bindingsposition, der viser den afgørende interaktion mellem remanensen og substratet ved rod-middel-kvadratafvigelse (RMSD) < 2 liter, valgt. Som et eksempel for acetyl-CoA docking blev bindingspositionen, der udviser hydrogenbindingen mellem Ser-148 og N71 af CoA, valgt . Til docking af alkohol blev bindingspositionen, der viser hydrogenbindingen mellem N3 af his-189 og alkoholens hydroksyl, valgt .

in silicomutageneseanalyse

in silicomutageneseanalyse af acetyl-CoA–isobutanol–CATSa-komplekset blev udført som tidligere beskrevet . Specifikt blev Moe’ alaninscanning ‘og’ restscanning ‘ – værktøjerne brugt til at identificere de potentielle restkandidater til mutagenese.

molekylær kloning

Plasmidkonstruktion

plasmider blev konstrueret ved standardmolekylær kloningsteknik af ligaseafhængig metode og/eller Gibson-samling ved hjælp af primere, der er anført i yderligere fil 1: tabel S1. De konstruerede plasmider blev introduceret i E. coli TOP10 ved varmechoktransformation. Kolonier isoleret på en selektiv plade blev PCR screenet og plasmid oprenset. De oprensede plasmider blev verificeret via Sanger-sekventering, inden de blev omdannet til E. coli BL21 (DE3). Stedstyret mutagenese blev udført ved hjælp af hurtigskiftningskirken-stedstyret mutageneseprotokol med reduceret overlapningslængde eller Gibson-samlingsmetode . Til C. thermocellum engineering blev plasmidet pHS005 konstrueret først og derefter modificeret til pHS0024. pHS0024 har ingen hpt ved nedstrøms for operonen, mens andre sekvenser af plasmidet er identiske med pHS005.

Transformation

de konventionelle kemiske transformations-og elektroporationsmetoder blev anvendt til transformation af henholdsvis E. coli og C. thermocellum. For C. thermocellum, metoden, imidlertid, blev let modificeret som beskrevet her. Først blev C. thermocellum M1354 (tabel 2) dyrket i 50 mL CTFuD-ny medium ved 50 liter C inde i et anaerobt kammer (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., ELLER, USA). Cellekulturen med OD i et område på 0,8-1,0 blev afkølet ved stuetemperatur i 20 minutter. Ud over dette punkt blev alle trin udført uden for kammeret. De afkølede celler blev høstet ved 6500 liter g og 4 liter C i 20 minutter. Cellepellets blev vasket to gange med iskølet Milli-kV vand og resuspenderet i 200 liter af transformationsbufferen bestående af 250 mM saccharose og 10% (v/v) glycerol. Flere 30 liter alikvoter af de elektrokompetente celler blev straks opbevaret ved-80 liter C til videre brug. Til elektroporation blev de elektrokompetente celler optøet på is og inkuberet med 500-1000 ng methylerede plasmider i 10 minutter. Derefter blev cellerne overført til en iskølet 1 mm hul elektroporation kuvette (Harvard apparatur, MA, USA) efterfulgt af to på hinanden følgende eksponentielle henfaldsimpulser med 1.8 kr., 350 kr. og 25 kr. Pulserne resulterede normalt i en 7,0–8,0 ms tidskonstant. Cellerne blev straks resuspenderet i forvarmet frisk ctfud-NY og genvundet ved 50 liter C under anaerob tilstand (90% N2, 5% H2 og 5% CO2) inde i et gummidækket Balchrør. Efter 0-12 timers genvinding blev cellerne blandet med smeltet ctfud-ny-agarmedium suppleret med 15 liter/mL thiamphenicol. Endelig blev mellemcelleblandingen hældt på en petriskål og størknet inde i det anaerobe kammer. Pladen blev inkuberet ved 50 liter C op til 1 uge, indtil kolonier dukkede op. Transformationseffektiviteten var 2-100 kolonidannende enheder pr.

in vivo karakterisering af CATSa og dens varianter i E. coli

til in vivo karakterisering af CATSa og dens varianter i E. coli blev kulturer med høj celletæthed udført som tidligere beskrevet med en tilsætning af 2 g/L af forskellige alkoholer. Til in situ-ekstraktion af estere blev hvert rør overlejret med 25% (v/v) heksadecan. For at bekræfte Proteinekspressionen af CATSa og dens varianter blev 1% (v/v) stamceller dyrket natten over ved 37 liter C og 200 o / min i 15 mL dyrkningsrør indeholdende 5 mL LB-medium og antibiotikum. Derefter blev 4% (v/v) af kulturerne natten over overført til 1 mL lb-medium indeholdende antibiotikum i en 24-brønds mikroplade. Kulturerne blev dyrket ved 37 liter C og 350 omdr. / min. ved hjælp af en inkuberende mikroplastryster (Fisher Scientific, PA, USA), indtil OD nåede til 0,4–0,6 og derefter induceret af 0.1 mM isopropylkrus-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i 4 timer med en åndbar tætningsmembran for at forhindre fordampning og krydskontaminering (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). Proteinprøverne blev opnået ved anvendelse af B-per komplet reagens (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA) ifølge producentens instruktion og analyseret af SDS-PAGE.

karakterisering

his-tag oprensning

til ekspression blev en kultur natten over inokuleret med en 1:50-forhold i frisk LB-medium indeholdende 1 mM IPTG og antibiotikum, efterfulgt af 18 kg c inkubation natten over (op til 20 timer) i en rystende inkubator ved 200 o / min. De inducerede celler blev høstet ved centrifugering ved 4 liter C og 4700 liter g i 10 minutter. Cellepelleten blev derefter vasket en gang med Millipore vand og resuspenderet i B-pr komplet reagens. Efter 30 min inkubation ved stuetemperatur blev blandingen centrifugeret ved 17.000 liter g i 2 min. Supernatanten blev opsamlet og betegnet som rå ekstrakt. Til rensning af hans tag blev det rå ekstrakt inkuberet med HisPur Ni–Nta superflød agarose i en batch, som producenten anbefaler. Derefter blev harpiksen vasket med mindst tre volumener vaskebuffer bestående af 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidasol og 0,1 mM EDTA. De harpiksbundne proteiner blev elueret med en elueringsbuffer på 300 liter indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 300 mM og 0,1 mM EDTA. Den eluerede prøve blev derefter afsaltet og koncentreret via en amicon filterkolonne med 10 kDa molekylvægt cut-off. Endelig blev proteinprøven suspenderet i 200 liter på 20 mM Tris–HCl-buffer (pH 8,0). Proteinkoncentrationen blev målt ved Bradford-analysen med bovint serumalbumin (BSA) som referenceprotein.

termisk skiftassay

til måling af proteinsmeltningstemperatur (Tm) blev der anvendt et termofluorassay med SYPRO Orange . Omkring 10-250 liter af his-tag oprenset protein blev blandet med 5 liter SYPRO Orange i et 50 liter slutvolumen i en 96-brønds kvpcr-plade. Pladen blev forseglet med PCR-hætter, før analysen blev kørt. StepOne real-time PCR-maskine (Applied Biosystems, CA, USA) blev brugt til at køre analysen med følgende parametre: ROKSREPORTER, 1 liter C-stigning pr.cyklus, 1 minut hold ved hver cyklus og temperaturområde fra 20 til 98 liter C. dataene blev indsamlet, eksporteret og behandlet for at beregne Tm.

5,5′-dithiobis-(2-nitrobenssyre) (DTNB)-analyse

reaktionshastigheden for hver kat blev bestemt ved en dtnb-analyse i en 384-brøndsplade. Det samlede reaktionsvolumen var 50 liter med reaktionsbufferen bestående af 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Koncentrationerne af acetyl-CoA (Coala Biosciences, USA) og alkoholer blev varieret som specificeret i hvert forsøg. Til reaktionerne over for hhv.chloramphenicol og alkoholer blev der anvendt endelige koncentrationer på 0,05 liter/mL og 10 liter/mL. Reaktionskinetik blev opsamlet ved at måle absorbans ved 412 nm hvert minut i 1 time ved 50 liter C i en mikropladelæser (Synergy. Reaktionshastigheden blev beregnet ved hjælp af udryddelseskoefficienten fra en standardkurve for frit coensym A (MP biomedicinske stoffer, OH, USA) under samme tilstand. Det skal bemærkes, at da den maksimale driftstemperatur, der anbefales til pladelæseren, er 50 liter C, blev high-throughput-analysen for CAT ved forhøjede temperaturer kun udført for at bestemme kinetikparametre.

beregning af kinetiske parametre for reaktionshastigheder

parametrene for Michaelis–Menten Sats lov (Ek. 1) blev beregnet for hver af dem som følger. Først blev lineær regression udført på data indsamlet fra en mikropladelæser for at identificere indledende reaktionshastigheder, \(y_{i}\), ved forskellige indledende substratkoncentrationer, \(s_{i}\), hvor i = {1,2,…,n} er antallet af indsamlede datapunkter. Derefter var disse indledende reaktionshastigheder og tilhørende initiale substratkoncentrationer for alle replikater samtidig tilpasset Michaelis–Menten-modellen. 1) ved hjælp af robust ikke-lineær regression. 2) med en soft-L1-loss estimator. 3) som implementeret i SciPy numerisk computing bibliotek v1.2.0 :

problemet med mindste kvadrater bestemmer parametrene \(K_ {\tekst{M}}\) og \(v_{ \tekst{maks}}\) ved at minimere forskellen mellem modelens forudsagte reaktionshastigheder \(v_{i}\) og målte reaktionshastigheder \(y_{i}\) (Ek. 2). En udjævningsfunktion \(\rho \left (å\ højre)\) bruges til at gøre det mindste firkantede problem modstandsdygtigt over for outliers. 3). På grund af den upartiske modstand mod outliers og undgåelse af fejl som følge af konventionelle lineariseringsmetoder giver robust ikke-lineær regression det mest præcise parameterestimat for Michaelis–Menten-modellen .

Isobutylacetatproduktion i C. thermocellum

cellobiosefermentering

Isobutylacetatproduktion fra cellobiose i C. thermocellum-stammer blev udført ved totrins biokonverteringskonfigurationen. Celler blev først dyrket i MTC minimalt medium indeholdende 5 g/L cellobiose i et gummidækket Balchrør, indtil OD nåede 0,8–1.0. Cellerne blev afkølet ved stuetemperatur i 20 minutter og centrifugeret ved 4700 liter g og 4 liter C i 20 minutter. Efter fjernelse af supernatanten blev cellerne resuspenderet i det samme volumen frisk MTC minimalt medium indeholdende 2 g/L isobutanol i et anaerobt kammer. Cellesuspensionen blev derefter opdelt i 800 liter i et 2,0 mL skruelåg-mikrocentrifugerør med et 200 liter sekskant-overlay. Cellerne blev inkuberet ved 55 liter C i 24 timer efterfulgt af analyse af gaskromatografi kombineret med et massespektrometer (GC/MS) for at kvantificere mængden af produceret isobutylacetat.

Cellulosefermentering

til cellulosefermenteringen blev modificeret MTC-medium (C-MTC-medium) anvendt. 20 g/L Avicel PH-101 blev anvendt som en eneste carbonkilde i stedet for cellobiose, og 10 g/L Mopper blev tilsat for at øge bufferkapaciteten. Den oprindelige pH blev justeret til 7,5 med 5 M KOH og autoklaveret. I et anaerobt kammer blev 0,8 mL cellekultur natten over inokuleret i 15,2 mL C-MTC-medium (1:20 inokulationsforhold) med 4 mL overlejret geksadecan. Hvert rør indeholdt en lille magnetisk omrøringsstang til homogenisering af cellulose. Det gummidækkede Balchrør blev inkuberet i et vandbad forbundet med en temperaturregulator indstillet til 55 liter C og et magnetisk omrøringssystem. Efter pH-justering med 70 liter på 5 M KOH–injektion blev der udtaget 800 liter cellekultur og 200 liter geksadecanlag hver 12. time.Kultur-pH blev opretholdt inden for et område på 6,4-7,8 under fermenteringen.

cellevækst blev overvåget ved måling af pelletsprotein. Cellecellecellulosepelleten fra 800 liter prøveudtagningsvolumener blev vasket to gange med Milli-kV vand og suspenderet med 200 liter lysisbuffer (0.2 M NaOH, 1% SDS) efterfulgt af en times inkubation ved stuetemperatur. Derefter blev opløsningen neutraliseret med 50 liter 0,8 M HCI og fortyndet med 550 liter vand. Blandingen blev centrifugeret ved 17.000 liter g i 3 minutter. Proteinkoncentration fra supernatanten blev analyseret ved det vaskemiddelkompatible Bradford-assay (Thermo Scientific, V, USA). Den resterende pellet blev kogt i en 98 liter C ovn i en time før kvantificering af resterende cellulose.

Restcellulose blev kvantificeret ved phenol–svovlsyremetoden med nogle modifikationer. Den kogte prøve blev vasket to gange med Milli-kV vand og suspenderet i 800 liter vand for at gøre tilsvarende volumen til originalen. Prøven blev homogeniseret ved pipettering og hvirvel i 10 s, og 20 liter af den homogeniserede prøve blev overført til et nyt 2,0 mL mikrocentrifugerør eller 96-brøndsplade og tørret natten over i en 55 liter C ovn. Den tørrede pellet blev suspenderet i 200 liter 95% svovlsyre og inkuberet i en time ved stuetemperatur. Efter at pelleten var opløst fuldstændigt, blev der tilsat 20 liter 5% phenol og blandet med svovlsyreopløsningen. Efter 30 min inkubation ved stuetemperatur blev 100 liter af prøven overført til en ny 96-brøndsplade, og absorbansen ved 490 nm blev målt. Absorbansen blev omdannet til cellulosekoncentration ved hjælp af standardkurven for Avicel PH-101 behandlet ved samme procedure.

analysemetoder

højtydende væskekromatografi (HPLC)

ekstracellulære metabolitter blev kvantificeret ved hjælp af et højtydende væskekromatografisystem (HPLC)., MD, USA). 800 liter kulturprøver blev centrifugeret ved 17.000 liter g i 3 minutter, og derefter blev supernatanterne filtreret gennem 0,2 liter filtre og kørt med 10 mn H2SO4 mobil fase ved 0,6 mL/min på en Amineks HPH-87H (Biorad Inc. C. Brydningsindeksdetektor (RID) og ultraviolet detektor (UVD) ved 220 nm blev brugt til at overvåge koncentrationer af sukkerarter, organiske syrer og alkoholer.

gaskromatografi kombineret med massespektroskopi (GC/MS)

estere blev målt ved GC (HP 6890, Agilent, CA, USA) udstyret med en MS (HP 5973, Agilent, CA, USA). Til GC-systemet blev kapillærkolonnen (30 m liter 0,25 mm liter 0,25 liter) anvendt til at adskille analytter, og helium blev anvendt som bærer med en strømningshastighed på 0,5 mL/min. Den ovn temperatur program blev fastsat som følger: 50 °C indledende temperatur, 1 °C/min rampe op til 58 °C, 25 °C/min rampe op til 235 °C 50 °C/min rampe op til 300 °C, og 2-min bage-ud til 300 °C. 1 µL af stikprøven hexadecane lag blev sprøjtet ind i kolonne i splitless mode med en injektor temperatur på 280 °C. For MS-systemet blev valgt iontilstand (SIM) anvendt til at detektere og kvantificere estere med følgende parametre: (i) ethylacetat, m/å 45,00 og 61,00 fra 4,2 til 4,6 min retentionstid (RT), (ii) isopropylacetat, m/å 45 og 102 fra 4,7 til 5,0 min RT, (iii) propylacetat, m/å 59 og 73 Fra 5,2 til 5,8 min RT, (iv) ethyl isobutyrat, m/al 73 og 116 fra 6,1 til 6,6 min rt, (v) isobutylacetat, m/al 61 og 101 fra 6,6 til 7,6 min rt, (vi) butylacetat, m/al 61 og 116 fra 7,7 til 9,2 min rt, (VII) isobutylisobutyrat, m/al 89 og 129 fra 10,1 til 12.5 min RT, 108 og 150 fra 13,1 til 13,8 min RT, og 2-phenethylacetat, 104 og 121 fra 13,8 til 15,5 min RT. isoamylalkohol og isoamylacetat blev anvendt som de interne standardanalytter. Esterne blev identificeret ved RT og kvantificeret ved spidsområder og standardkurver. Standardkurver blev bestemt ved anvendelse af rene estere fortyndet i heksadecan i koncentrationer på 0,01 g/ L, 0,05 g/ L, 0,1 g/ L, 0,5 g / L og 1 g/L.