det spaltede-Caspase-3-antistof er en markør for Caspase-9-lignende DRONC-aktivitet i Drosophila

mærkning af det spaltede-Caspase-3-antistof vedvarer i DCP-1-drICE dobbeltmutanter

for at evaluere specificiteten af den spaltede-Caspase-3-antistof, der antistof, vi analyserede øje imaginal diske fra tredje instar larver. I vildtype øjenbilledskiver registrerer antistoffet et par døende celler spredt over hele disken (figur 1a). Overraskende, i øjet diske dobbelt mutant for null alleler dcp-1prev og drice prist1 (ref.14, 15) mærker det spaltede-Caspase-3-antistof stadig celler (figur 1b). Mærkning i DCP-1prev drice Trice 1 dobbeltmutanter forekommer i klynger (figur 1b), svarende til det, der tidligere er blevet observeret, da celledød blev blokeret af ekspressionen af Caspase-3-hæmmer P35.3 disse observationer antyder, at det spaltede-Caspase-3-antistof stadig detekterer en epitop i fravær af de Caspase-3-lignende proteiner DCP-1 og DRICE. Ikke desto mindre, da apoptose på dette stadium ikke forekommer i et defineret mønster, var vi usikre på specificiteten af disse mærkningssignaler.

derfor brugte vi GMR-hid transgener, en velkarakteriseret apoptotisk model,5 for yderligere at undersøge specificiteten af det spaltede Caspase-3-antistof. Gennem GMR-drevet ekspression af det pro-apoptotiske gen hid specifikt i den bageste halvdel af det udviklende øje inducerer GMR-hid-transgener apoptose i to forskellige bølger som vist ved spaltet-Caspase-3-antistof og TUNEL-etikettering28 (figur 1C, d). For at evaluere specificiteten af det spaltede-Caspase-3-antistof undersøgte vi GMR-hid-øjeskiver, der var dobbelt mutant for dcp-1prev og drice lut1. I overensstemmelse med forventningen ophæver tab af DCP-1prev og drice kurs1 fuldstændigt TUNEL-positiv apoptose i GMR-hid-diske (figur 1F). Overraskende nok udviste dcp-1prev drice price 1 dobbeltmutant GMR-hid øjenskiver stadig stærk immunoreaktivitet med spaltet-Caspase-3-antistof (figur 1e). Således detekterer det spaltede-Caspase-3-antistof ikke eller ikke kun DRICE og/eller DCP-1. Vi bemærker dog, at mærkningsudseendet af det spaltede Caspase-3-antistof ændres i fravær af DCP-1 og DRICE (sammenlign figur 1c og e). Mærkningssignalet er ikke længere begrænset til to forskellige bølger (figur 1C), men fylder snarere hele det bageste rum på øjenskiven og er begrænset til interommatidiale celler (figur 1e). En lignende ændring af mærkningsmønster er rapporteret for CM1-antistofmærkning ved ekspression af caspasehæmmeren P35.3 Denne ændring af mærkningsmønsteret skyldes sandsynligvis det faktum, at celler i DCP-1prev drice purp1 double mutant GMR-hid eye discs ikke dør (figur 1F) og således opretholder epitopen detekteret af spaltet-Caspase-3 antistof. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at denne analyse demonstrerer påvisning af en epitop i fravær af Caspase-3-lignende proteiner DCP-1 og DRICE ved spaltet-Caspase-3-antistof.

immunoreaktivitet af det spaltede-Caspase-3-antistof afhænger af apoptosomkomponenterne DRONC og ARK

der er to muligheder, hvorfor de spaltede-Caspase-3-antistofmærker DCP-1 drICE dobbeltmutante celler, selvom de ikke er apoptotiske. For det første kan antistoffet muligvis ikke detektere en apoptotisk epitop; eller for det andet kan antistoffet detektere en apoptotisk epitop genereret opstrøms eller parallelt med DCP-1 og DRICE. For at skelne mellem disse muligheder undersøgte vi GMR-hid eye discs mutant for apoptosomkomponenterne DRONC og ARK, som virker opstrøms for DRICE og DCP-1. I dronc-og ark-mutant GMR-hid-øjeskiver blokeres både TUNEL-og spaltet-Caspase-3-antistofetiketter (Figur 1 g, h; figur 3a,b). Disse data bekræfter, at det spaltede-Caspase-3-antistof faktisk detekterer en apoptotisk epitop i Drosophila. Desuden, fordi det ikke registrerer den apoptotiske epitop i dronc-og ark-mutanter, men ikke i DCP-1 drICE-dobbeltmutanter, er det mere nøjagtigt at betragte det spaltede-Caspase-3-antistof som en markør for DRONC-aktivitet snarere end effektor caspase-aktivitet i døende Drosophila-celler.

tripeptid – ETD er den apoptotiske epitop detekteret af spaltet-Caspase-3-antistof

epitopen detekteret af det spaltede-Caspase-3-antistof afhænger af DRONC-aktivitet. Det kan være muligt, at antistoffet direkte genkender aktiveret DRONC. Alternativt er det også muligt, at det spaltede Caspase-3-antistof detekterer en epitop genereret gennem spaltning af et ukendt substrat af aktiv DRONC uafhængigt af DRICE og DCP-1.

for at skelne mellem disse to muligheder justerede vi resterne fra den katalytiske cystein (Cys163) til spaltningsstedet ved Asp175 af human Caspase-3 (Caspase-3 peptid) med de tilsvarende regioner af Drosophila caspaser (figur 2a; se også ref. 3). De mest C-terminale rester af Caspase – 3-peptidet, ETD, er konserveret i DRICE og DCP-1 (Figur 2a). I lighed med Caspase-3 er dette spaltningsstedet til aktivering af mindst DRICE, 29 og muligvis DCP-1. Det er interessant at bemærke, at N-terminalen, to tredjedele af Caspase-3-peptidet, har den højeste lighed med DRONC; seks ud af ni rester er konserveret (figur 2a). Denne del af Caspase-3-peptidet er mindre velbevaret i DRICE, DCP-1 og de resterende Drosophila caspaser. Selvom spaltning mellem de store og små underenheder af DRONC ikke er nødvendig for dens aktivitet,30, 31 og muligvis ikke forekommer in vivo, overvejede vi muligheden for, at antistoffer rettet mod den N-terminale del af Caspase-3-peptid direkte kan detektere aktiv DRONC i døende celler.

vi brugte blokerende peptider til at evaluere, hvilke epitoper af Caspase-3-peptidet detekteres af det spaltede-Caspase-3-antistof i døende Drosophila-celler. Sekvenserne af de blokerende peptider er vist i figur 2b og understreget i figur 2a. Blokerende peptid A (TETD) er afledt af DRICE og DCP-1,og blokerende peptid B (CRGDEYDLG) svarer til regionen med den højeste lighed i DRONC (figur 2A, b). Peptid C er et kontrolpeptid svarende til resterne umiddelbart ved siden af peptid B i DRONC (figur 2A,b). Peptid D er et andet kontrolpeptid, som meget ligner peptid A og er afledt af DRONC ‘ s prodomæne i position 113. Hvis PRODOMÆNET af DRONC spaltes på dette sted, vil det udsætte ESD ved dets C-terminal, hvilket meget ligner C-terminalen af Caspase-3-peptidet (ETD, peptid A) og kan således detekteres af det spaltede-Caspase-3-antistof.

de blokerende peptider blev blandet med det spaltede-Caspase-3-antistof 60 min før inkubation med øjenbilledskiverne. Resultaterne af blokeringseksperimenterne er opsummeret i figur 2b og for peptiderne A og B vist i figur 2C–f. Peptid A er tilstrækkeligt til at blokere hele immunoreaktiviteten af det spaltede-Caspase-3-antistof i GMR-hid og i DCP-1 drICE double mutant GMR-hid eye discs (figur 2C,D). I modsætning hertil ophæver peptid B ikke immunreaktivitet af antistoffet i disse diske (figur 2e,f). Kontrolpeptiderne C og D undlader også at blokere spaltet-Caspase-3 immunoreaktivitet (figur 2b; data ikke vist).

disse data viser, at det spaltede-Caspase-3-antistof specifikt detekterer epitopetd i apoptotiske celler. Blandt Drosophila caspaser er denne epitop kun til stede i DRICE og DCP-1, hvilket gør det meget sandsynligt, at antistoffet faktisk registrerer disse effektor caspaser. I modsætning hertil antyder det faktum, at de DRONC-afledte peptider B, C og D ikke blokerer immunoreaktivitet, at det er usandsynligt, at antistoffet direkte detekterer aktiv DRONC. Fordi det spaltede-Caspase-3-antistof ikke mister immunoreaktivitet i DCP-1 drICE-dobbeltmutanter (figur 1e), detekterer det mindst et andet protein, der udsætter ETD-epitopen på en DRONC-afhængig måde.

aktivering af DCP-1 uafhængigt af ARK gendanner spaltet-Caspase-3 immunoreaktivitet

analysen præsenteret i figur 2 antyder, men beviser ikke, at det spaltede-Caspase-3-antistof faktisk detekterer spaltet DCP-1 og DRICE. For direkte at teste denne mulighed, vi udtrykte en GMR-Kristn-dcp-1 transgen i ark mutant baggrund. Der mangler Det N-terminale prodomæne af DCP-1. Det menes, at prodomain-forarmet LARP-DCP-1 let fremmer autoprocessing, og konsistent ekspression under GMR-kontrol inducerer en øjenablationsfænotype.32 denne øjenablationsfænotype er forårsaget af induktion af apoptose (figur 3c,d). Som nævnt ovenfor inducerer ark-mutantkloner i GMR-hid-baggrund ikke TUNEL-positiv apoptose (figur 3b), og det spaltede Caspase-3-antistof har ingen immunreaktivitet i ark-kloner (figur 3a), hvilket antyder, at hverken DCP-1 eller DRICE eller de ukendte DRONC-substrater spaltes i ark-mutante kloner. Derfor testede vi, om ekspression af PRISTN-Dcp-1 i fravær af apoptosomaktivitet, det vil sige i ark-kloner, kan gendanne spaltet-Caspase-3-antistofmærkning. Sammenlignet med vildtypevæv (markeret med GFP i figur 3c,c’) reduceres antallet af spaltede-Caspase-3-positive celler kraftigt i ark-mutantkloner (figur 3c, c’), hvilket antyder, at aktivering af LARPN-DCP-1 i det mindste delvist er afhængig af apoptosomet. Imidlertid indeholder omkring 50% af ark-mutantkloner (n=32) i GMR-LUTN-DCP-1 baggrund spaltede-Caspase-3 immunreaktive celler (pile i figur 3c, c’). Dette er usandsynligt, at være en mærkning artefakt, fordi disse celler også er TUNEL-positive (figur 3D, d’). Derfor, fordi DRONC er inaktiv i ark-mutant baggrund, der antyder, at det spaltede-Caspase-3-mærkningssignal ikke er forårsaget af det ukendte DRONC-substrat, viser denne analyse, at det spaltede-Caspase-3-antistof faktisk registrerer spaltet DCP-1. Det er også muligt, at det spaltede-Caspase-3-antistof detekterer spaltet DRICE i dette eksperiment, fordi DCP-1 proteolytisk kan behandle DRICE, i det mindste in vitro.29, 32 en lignende analyse med DRICE kunne ikke udføres, fordi GMR-drICE og GMR-prisT-drICE ikke forårsager en øjenablationsfænotype.32 uanset om DCP-1 spalter DRICE in vivo eller ej, i betragtning af sekvenslighed mellem DCP-1 og DRICE ved C-terminalen for den store underenhed og peptidblokeringsdataene i figur 2, antyder det, at antistoffet også kan detektere spaltet DRICE.