den industrielle anaerobe Clostridium acetobutylicum bruger polyketider til at regulere cellulær differentiering

bakteriestammer og medier

C. acetobutylicum ATCC 824 blev dyrket i et anaerobt kammer (Coy Laboratorieprodukter) indeholdende en atmosfære af 97% nitrogen og 3% hydrogen. 2ksytg medium67 indeholdt 16 g/L trypton, 10 g/L gærekstrakt, 5 g/L NaCl og 10 g / L glucose (medmindre andet er angivet) med pH justeret til 5.2 for flydende medier og 5,8 for faste medier (også indeholdende 15 g/L agar). Clostridial vækstmedium (CGM)68 indeholdt 30 g/L glucose (medmindre andet er angivet), 6,25 g/L gærekstrakt, 2,5 g/L ammoniumsulfat, 1,25 g/L NaCl, 2,5 g/L asparagin, 0,95 g/L monobasisk kaliumphosphat, 0,95 g/L dibasisk kaliumphosphat, 0,5 g/L magnesiumsulfatheptahydrat, 13 mg/L mangansulfatheptahydrat og 13 mg/L jernsulfatheptahydrat med pH justeret til 6,4. P2 medium69 indeholdt 80 g/L glucose (medmindre andet er angivet), 1 g/L gærekstrakt, 2,2 g/l ammoniumacetat, 0.5 g/L kaliumphosphat monobasisk, 0,5 g/l kaliumsulfat dibasisk, 0,2 g/l magnesiumsulfatheptahydrat, 1 mg/L para-aminobenssyre, 1 mg/L thiaminhydrochlorid, 10 liter/l biotin, 10 mg/l mangansulfatheptahydrat, 10 mg/L ferrosulfatheptahydrat og 10 mg/L NaCl med pH justeret til 6,4. Clostridial basal medium (CBM)70 indeholdt 10 g/L glucose, 0,5 g/L monobasisk kaliumphosphat, 0,5 g/L dibasisk kaliumphosphat, 4 g/L trypton, 0.2 g/L magnesiumsulfatheptahydrat, 10 mg/L mangansulfatheptahydrat, 10 mg/L ferrosulfatheptahydrat, 1 mg/l para-aminobenssyre, 1 mg/L thiaminhydrochlorid og 2 liter/l biotin med pH justeret til 6,9. Til faste CGM-plader blev der tilsat 15 g / L agar. CBM – s (anvendt til flydende sporulationsassays) var identisk med CBM undtagen 50 g/L glucose blev anvendt, og 5 g/L CaCO3 blev tilsat lige før podning af kulturer. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) blev dyrket i Luria-Bertani (LB) medium ved 37 liter C. For de passende Clostridium-stammer blev kulturmedier suppleret med erythromycin (ERY; 40 liter/mL for faste medier, 80 liter/mL for flydende medier) og/eller thiamphenicol (Th; 5 liter/mL for faste og flydende medier). Kanamycin (kan; 60 liter / mL) eller chloramphenicol (Cm; 25 liter/mL) blev tilsat til E. coli-dyrkningsmedier som angivet. Clostridium-og E. coli-stammer blev opretholdt som 20% v/v glycerollagre opbevaret ved -80 liter C.

Plasmidkonstruktion

oligonukleotider blev tilvejebragt ved hjælp af integrerede DNA-teknologier (supplerende tabel 5). Phusion polymerase (NEB) blev anvendt til alle PCR-reaktioner. Til isolering af genomisk DNA fra C. acetobutylicum ATCC 824 blev der anvendt en alkalisk lysis metode71. C. acetobutylicum blev dyrket natten over i 2ksytg medium til stationær fase (OD600 > 2,0), hvorefter 10 mL kultur blev centrifugeret ved 3500 liter g i 15 minutter (stuetemperatur). Supernatanten blev kasseret, og cellepelleten blev resuspenderet i 5 mL sæt buffer (75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Til en slutkoncentration på 2 mg/mL, og opløsningen blev forsigtigt blandet. Blandingen blev inkuberet ved 37 liter C i 60 minutter med blid blanding udført hvert 15.minut. Efter inkubationsperioden blev der tilsat 660 liter lysisbuffer (1 M NaOH, 10% Vægt/V SDS), og opløsningen blev grundigt blandet. Proteinase K blev tilsat til en slutkoncentration på 0,5 mg / mL, og opløsningen blev inkuberet ved 55 liter C i 1 time. efter denne inkubationsperiode blev der tilsat et lige stort volumen phenol:chloroform (1:1), og opløsningen blev blandet ved inversion i 5 min. Opløsningen blev derefter centrifugeret ved 3500 liter g i 15 minutter (stuetemperatur), og den øvre vandige fase blev kasseret ved pipettering. Til den organiske fase blev 3 M natriumacetat tilsat (10% v/v I endelig opløsning). For at udfælde genomisk DNA blev der tilsat 2 volumener ethanol, og opløsningen blev blandet. Udfældet genomisk DNA blev opsamlet ved hjælp af en glaskrog og vasket med 70% ethanol. Det vaskede DNA blev derefter tørret over nitrogengas i 15 minutter, resuspenderet i lav te-buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) og opløst ved inkubation ved 50 liter C.

til konstruktion af plasmid pko_masf_mod (som senere skulle tjene som en skabelon for pKO_pks), primere pKON_Fo og pKON_Ro blev brugt til PCR amplificere en 5,0 kb region fra pko_masf template15. Dette trin var nødvendigt for at fjerne en 677 bp-region fra rygraden, som vi ikke var i stand til at forstærke via PCR. PCR-produktet på 5,0 kb blev gelrenset, fordøjet ved 5 ‘og 3’ enderne ved anvendelse af PshAI, ligeret til dannelse af pko_masf_mod og omdannet til E. coli TOP10. Transformerende kloner blev screenet ved oprenset plasmid testfordøjelse, og Sanger-sekventering blev brugt til at bekræfte sekvensen af den endelige pko_masf_mod-klon. Til konstruktion af plasmid pKO_pks (til deletion af pks-genet fra C. acetobutylicum) blev en 3,8 kb-region indeholdende colE1, repL, bgaR og MSF PCR-amplificeret fra pko_maf_mod ved anvendelse af primere pKO_F og pKO_R. derudover blev primere UHR_Fo og UHR_Ro og DHR_Fo og DHR_Ro anvendt til PCR-amplifikation af 1 kb-regioner, der repræsenterer de opstrøms og nedstrøms homologe regioner (UHR og DHR) flankerer PKS-genet (ca_c3355) fra et C. acetobutylicum ATCC 824 genomisk DNA-skabelon. Chloramphenicol / thiamphenicol-resistensgenet og konstitutiv promotor (p ptb fra C. acetobutylicum) blev PCR-amplificeret fra pko_masf_mod ved anvendelse af primere CMR_F og CMR_R (1,1 kb-region). Disse fire PCR-produkter blev ligeret via Gibson-samling og omdannet til E. coli TOP10. Transformantkloner blev screenet ved oprenset plasmid testfordøjelse, og Sanger-sekventering blev brugt til at bekræfte sekvensen af den endelige pKO_pks-klon. Til konstruktion af plasmid pAN315 (nødvendig til methylering af pko_pk ‘er og pko_pk’ er før omdannelse til C. acetobutylicum), en 6,4 kb region fra plasmid pAN172 blev amplificeret ved anvendelse af primere pAN1_F og pAN1_R, og en 1,0 kb region indeholdende kanamycinresistensgenet fra vektor pCOLA_Duet blev amplificeret ved anvendelse af primere kan_fo og kan_ro. De gelekstraherede PCR-produkter blev ligeret via Gibson-samling og omdannet til E. coli TOP10. Transformantkloner blev screenet ved oprenset plasmid testfordøjelse, og Sanger-sekventering blev brugt til at bekræfte sekvensen af den endelige pAN3-klon. Til konstruktion af plasmid pCKO_pks (til ekspression af pks-genet under den konstitutive crotonasepromotor fra C. acetobutylicum), primere CPKS_Fo og CPKS_Ro blev brugt til PCR-amplifikation af 5,4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks-genet (CA_C3355) med passende overhæng til Gibson-samling. Vector71-rygraden (indeholdende den konstitutive crt-promotor opstrøms for det multiple kloningssted) blev PCR amplificeret ved anvendelse af primere pvis_f og pvis_r, hvilket gav et 5,0 kb produkt. De to gelrensede PCR-produkter blev ligeret via Gibson-samling og omdannet til E. coli TOP10. Transformantkloner blev screenet ved oprenset plasmid testfordøjelse, og Sanger-sekventering blev brugt til at bekræfte sekvensen af den endelige pkko_pks-klon.

til konstruktion af plasmid pET24b_pks blev 5,4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks-genet (CA_C3355) amplificeret fra C. acetobutylicum genomisk DNA ved anvendelse af primere PKS_Fo og PKS_Ro. Dobbelt fordøjet vektor pET24b (EcoRI/Khoi fordøjet) blev ligeret med dobbelt fordøjet pks PCR-produkt (EcoRI/Khoi fordøjet), og ligeringsproduktet blev omdannet til E. coli TOP10. Transformantkloner blev screenet ved oprenset plasmid testfordøjelse, og Sanger-sekventering blev brugt til at bekræfte sekvensen af den endelige pET24b_pks-klon.

Elektro-transformation af C. acetobutylicum

før transformation til C. acetobutylicum blev vector pKO_pks Co-transformeret med pAN3 til E. coli TOP10 via elektroporation. Denne procedure tillod methylering af pko_pk ‘ er, der var nødvendige for at overvinde det native restriktions-modifikationssystem, der var aktivt i C. acetobutylicum 72. Plasmidrensning af E. coli pKO_pks / pAN3 væskekultur blev udført, og den resulterende plasmidblanding blev anvendt til elektroporationer af C. acetobutylicum under anvendelse af den tidligere offentliggjorte metode72, som vi beskriver her. For at forberede elektrokompetente celler blev en enkelt koloni af C. acetobutylicum fra en 2ksytg-plade (mere end 1 uge gammel) varmechokeret ved 80 liter C i 10 minutter og brugt til at inokulere 10 mL CGM. Efter inkubation natten over ved 37 liter C og opnåelse af Mid-eksponentiel fase (OD600 0,4–0,9) blev 6 mL kultur anvendt til at inokulere 54 mL frisk 2 kg. Denne subkultur blev inkuberet ved 37 kr. C, indtil den nåede OD600 1.2 (~5 h), på hvilket tidspunkt subkulturen blev centrifugeret ved 3500 liter g i 20 minutter (4 liter C). Efter fjernelse af supernatanten blev cellepelleten resuspenderet i 20 mL iskold elektroporationsbuffer (EPB; 270 mM saccharose, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4). De resuspenderede celler blev centrifugeret ved 3500 liter g i 10 minutter (4 liter C), supernatanten blev kasseret, og cellepelleten blev resuspenderet i 20 mL iskold EPB. Efter en endelig pelletering ved centrifugering ved 3500 liter g i 10 minutter (4 liter C) blev supernatanten kasseret, og pelleten blev resuspenderet i 2,3 mL iskold EPB. Denne endelige resuspension blev brugt som lager af elektrokompetente celler. Elektrotransformationer blev udført ved først at blande (over is) 500-kompetente celler og ~20-liter plasmid-DNA-opløsning (1-5-liter i alt), der skulle transformeres. Blandingen blev overført til en 0,4 cm elektroporationskuvette og fik lov til at inkubere på is i 15 minutter. Elektroporationer blev udført med følgende parametre: spænding, 2000 V; kapacitans, 25 liter; modstand, uendelig hastighed. Efter elektroporation blev prøverne resuspenderet i 1 mL 2ksytg og overført til et rør indeholdende 9 mL 2ksytg. Efter blanding ved inversion fik kulturerne lov til at komme sig ved 37 liter C i 4 timer. genvindingskulturerne blev centrifugeret ved 3500 liter g i 15 minutter (stuetemperatur), og supernatanten blev kasseret. Cellepelleten blev resuspenderet i 500 2ksytg, og 100 blev belagt på faste 2ksytg plader suppleret med det passende antibiotikum. Pladen blev inkuberet ved 37 liter C i 2-3 dage, og transformantkolonier blev underkastet PCR-baseret verifikation.

sletning af pks-gen og genetisk komplementering

målrettet KO af pks-genet (ca_c3355) i C. acetobutylicum ATCC 824 blev opnået ved anvendelse af den tidligere offentliggjorte metode15. I detaljer blev 5 liter methyleret pko_pks/pAN3 plasmidblanding omdannet til C. acetobutylicum under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor. Efter genfinding i flydende 2ksytg-medium i 4 timer blev cellepellets opsamlet ved centrifugering (3500 g, 15 min, stuetemperatur), opsuget i 0,5 mL frisk væske 2ksytg, og 100 g af den opsuspenderede cellekultur blev belagt på faste 2ksytg + 5 g/mL TH + 40 mM. Under disse pletteringsbetingelser forventes kun celler, der har gennemgået den ønskede homologe rekombinationsbegivenhed med dobbelt crossover, at overleve. Modvalg af vektorrygraden tilvejebringes af den lactoseinducible promotor (P bgaL ), som driver toksingenet på pko_pks vektorrygraden. Efter denne pletteringsprocedure blev der observeret ca.10 kolonier på 2 kg + 5 kg/mL Th + 40 mM liter-lactose plader. Af disse 10 kolonier blev fire to gange ombrudt og underkastet koloni-PCR-verifikation. Fire sæt primere blev anvendt som basis for koloni-PCR-verifikation, som beskrevet i supplerende Fig. 2.

til generering af PKS ‘ genetiske komplementeringsstamme blev elektroporation af purpur pks C. acetobutylicum med en pkko_pks/pAN3 plasmidblanding udført som beskrevet ovenfor. Efter elektroporation og genfinding blev kulturer belagt på faste 2ksytg + 5 liter/mL Th + 40 liter/mL Ery medier. Efter to gange restreaking på fast 2ksytg + 5 lp/mL Th + 40 lp/mL ERY medier, blev potentielle kolonier, der huser pcko_pk ‘ er, screenet via koloni PCR ved hjælp af primere pCKO_F og pCKO_R.

LC-HRMS metabolomisk analyse

for ikke-målrettede metabolomiske sammenligninger af vildtype og karrus pks C. acetobutylicum blev enkelte kolonier af hver stamme varmechokeret ved 80 karrus C i 10 minutter og anvendt til at inokulere 10 mL flydende CGM (30 g/L glucose). Efter inkubation natten over (stillestående), indtil de nåede OD600 ~1,0, blev disse kulturer brugt til at inokulere 10 mL flydende CGM (80 g/L glucose) med et 10% inokulum til subkulturering. Efter ~5 h (OD600 ~1.0) af stillestående vækst blev subkulturerne anvendt til at inokulere firdobbelt kolbe-fermenteringer (70 mL CGM, 80 g/L glucose + 5 liter antifoam 204, 3% inokulum) omrørt via magnetiske omrøringsstænger. Calciumcarbonat (6 g/L) blev suppleret til fermenteringsmediet til pH-buffering. Al dyrkning blev udført kl 37 liter C. Om 5 liter / mL Th blev inkluderet i alle kulturer af liter pks med undtagelse af den endelige fermenteringskultur, da visse antibiotika vides at forstyrre ABE-fermenteringsfaserne. Prøver af fermenteringsbuljong (1 mL) fra hver replikat blev taget i den tidlige stationære fase og ekstraheret med 3 mL 2:1 chloroformmethanol. Blandingerne blev virvlet, adskilt via centrifugering (2700 liter g, 10 min), og det nederste chloroformrige lag blev overført til et hætteglas. Disse organiske ekstrakter blev tørret med nitrogengas, resuspenderet i 100 liter methanol, og 10 liter blev injiceret på et Agilent Technologies 6520 nøjagtig masse af LC-MS-instrument udstyret med en Agilent Eclipse Plus C18-søjle (4,6 liter 100 mm). En lineær gradient på 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min i H2O med 0,1% myresyre (vol/vol) ved en strømningshastighed på 0,5 mL/min blev anvendt. Den metabolomiske analyseplatform HCMS16 (Scripps Research Institute) blev brugt til at sammenligne metabolomerne af vildtype-og PKS-stammer baseret på de firedobbelte LC-HRMS-data. MS peaks unikke for kurp pks (Fig. 1a) blev identificeret ved hjælp af følgende parametre: p-værdi < 0,01, foldændring > 10,0, topintensitet > 5000.

Bioreaktorfermenteringer

for at sammenligne ABE-fermenteringsprofiler af vildtype og liter pks C. acetobutylicum, bioreaktorfermenteringer blev udført i DASGIP bioreaktorer (4 liter GPI 100 fartøjer, DASGIP Biobloksystem) med 500 mL arbejdsmængder. Kulturer natten over (10 mL CGM, 30 g/L glukose, stillestående, 34 liter C) podet med varmechokerede individuelle kolonier af C. acetobutylicum blev dyrket, indtil de nåede OD600 ~1. Et 10% inokulum blev derefter brugt til at starte en subkultur (30 mL P2-medier, 80 g/L glukose, stillestående, 34 liter C), og subkulturen blev inkuberet, indtil den nåede OD600 ~1. De 30 mL subkulturer blev derefter aseptisk overført til individuelle Dasgip-bioreaktorer, der var fyldt med 500 mL P2-medium (80 g/L glucose, 100 liter antiskum 204, 34 liter C). Fermenteringerne fik lov til at fortsætte i 54 timer med periodisk prøveudtagning til optiske densitetsmålinger, fermenteringsproduktanalyse og kvantificering af forbindelser 1, 2 og 3. Temperaturen blev opretholdt ved 34 liter C under hele fermenteringen, omrøring blev tilvejebragt ved omrøring ved 200 o / min, og pH blev opretholdt over 5,0 via automatisk tilsætning af 3 M NH4OH. For at opretholde anaerobe forhold blev iltfri nitrogengas sparget med en hastighed på 2 sL/h i gæringens varighed. Til kvantificering af forbindelserne 1, 2 og 3 blev 1 mL fermenteringsbuljong blandet med 3 mL ethylacetat, virvlet, adskilt via centrifugering (2700 liter g, 10 min, stuetemperatur) og det øvre organiske lag isoleret. Det organiske lag blev tørret ved roterende fordampning, resuspenderet i 200 liter methanol, og 20 liter blev injiceret på et Agilent Technologies 6120 Kvadrupol LC-MS (med far) instrument udstyret med en Agilent Eclipse Plus C18 søjle (4,6 liter 100 mm). En lineær gradient på 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min i H2O med 0,1% myresyre (vol/vol) ved en strømningshastighed på 0,5 mL/min blev anvendt. Forbindelserne 1, 2 og 3 blev identificeret ved UV-absorption (240 nm) som vist i Fig. 1B, og blev kvantificeret ved hjælp af det integrerede spidsareal (absorbans ved 240 nm).

Fermenteringsanalytiske procedurer

et spektrofotometer blev anvendt til at bestemme celletætheder ved at måle den optiske densitet ved 600 nm (OD600). Et UFLC-system udstyret med en biorad-87H-søjle (300 mm til 7,8 mm) blev brugt til at analysere C. acetobutylicum fermenteringsbuljong til koncentration af glucose og fermenteringsprodukter (acetat, butyrat, lactat, acetone, butanol og ethanol). Prøver af fermenteringsbuljong (1 mL) blev først pelleteret ved centrifugering ved 10.000 liter g i 3 minutter efterfulgt af filtrering af supernatanten under anvendelse af et 0,22 mikron PVDF-sprøjtefilter. Prøver af filtreret supernatant (20 liter) blev injiceret på UFLC-systemet med 0,01 N svovlsyremobil fase, der strømmer ved 0,7 mL/min, søjletemperatur på 35 liter C og blev kromatograferet i 35 minutter. Analytter blev påvist ved anvendelse af en brydningsindeks detektor (bruges til at kvantificere koncentrationer af glucose, acetat, lactat, butanol og ethanol) og en diode array detektor (bruges til at kvantificere koncentrationer af butyrat (208 nm) og acetone (265 nm)).

RNA-isolering og RNA-Sekv-analyse

prøver (10 mL) fermenteringsbuljong blev udtaget i biologisk triplicat fra bioreaktorfermenteringer af vildtype-og PKS C. acetobutylicum 26 timer efter inokulation. Prøverne blev centrifugeret (4000 liter g, 10 min, 4 liter C), og pellets blev resuspenderet og opbevaret i Rnaprotect-Cellereagens (Chiagen). Total RNA blev ekstraheret ved hjælp af et Rneasy Mini Kit (Chiagen) ifølge producentens anvisninger. En DNase-behandling på kolonne blev udført under anvendelse af DNase i (RNase-fri) (NEB). RNA – kvalitetskontrol, bibliotekskonstruktion og biblioteksekventering blev udført af University of California-Berkeley funktionel Genomiklaboratorium og Vincent J. Coates genomisk Sekventeringslaboratorium. RNA-kvalitet og koncentration blev vurderet ved anvendelse af en nanochip på en Agilent 2100 Bioanalysator. Bakteriel 16S og 23S rRNA blev fjernet ved hjælp af et Ribosero Kit (Illumina). Det resulterende messenger-RNA (mRNA) blev konverteret til et RNA-sek-bibliotek ved hjælp af et mRNA-sek-bibliotekskonstruktionssæt (Illumina). RNA bibliotek sekventering blev udført på en Illumina Hisek4000 med 50 bp enkelt ende læser. Sekventering læser (50 bp ) blev behandlet og kortlagt til C. acetobutylicum ATCC 824 genomet (NCBI tiltrædelse NC_003030.1 og NC_001988.2) ved hjælp af CLC Genomics arbejdsbord 9.0 med standardparametre. Læser, der ikke entydigt stemte overens med genomet, blev kasseret. Forskelle i genekspression mellem vildtype og karrus pks C. acetobutylicum blev beregnet ved hjælp af det samme program. Gener blev betragtet som differentielt udtrykt med p-værdi < 0,003 (baseret på en uparret t-test, n = 3) og |normaliseret foldændring |> 2,0. Falske opdagelseshastighedskorrektioner til p-værdier blev beregnet i CLC Genomics arbejdsbord 9.0 ved hjælp af en offentliggjort metode73. Resultaterne af RNA-Sekv-analysen er præsenteret i supplerende Data 1. STRENGANALYSE30 blev udført for at bestemme formodede protein–protein-interaktioner mellem de differentielt udtrykte gener afsløret ved RNA-Sekv-analyse.

fænotype sammenligningsassays

flydende sporulationsassays blev udført med mindre modifikationer74. Prøver blev taget fra biologiske triplikatvæskekulturer efter 5 dages inkubation (30 mL CBM-s, 37 liter C). De 20 prøver blev varmechokeret (80 C, 10 min), fortyndinger (101-106) blev spottet på 2 ksytg plader, og kolonier blev opregnet efter 30 h inkubation (37 C) for at beregne antallet af varmebestandige kolonidannende enheder (cfu/mL). Til kemisk komplementering af purpur pks i væskesporulationsanalysen blev renset clostrienose (slutkoncentration 3,5 purpur) suppleret i CBM-s-kulturer af purpur pks C. acetobutylicum på inokulationstidspunktet. Da forbindelse 3 blev tilsat som en koncentreret opløsning i methanol, blev det ækvivalente volumen af methanol (60 liter) tilsat til alle andre væskesporulationsanalysekulturer (vildtype og ikke-komplementære PKS) for at kontrollere denne virkning.

til faste sporulationsanalyser blev en tidligere beskrevet metode75 anvendt med nogle ændringer. I detaljer blev varmechokeret (80 liter C, 10 minutter) individuelle kolonier dyrket i flydende medier (10 mL CGM, 37 liter C) i 24 timer. kulturer blev fortyndet med en faktor på 106 og belagt på fast CBM. Prøveudtagning blev udført 1, 2, 3, 4 og 6 dage efter den første plettering. Til prøveudtagning blev tre individuelle kolonier kombineret og grundigt resuspenderet i 60 liter flydende CGM. 20 liter af den resuspenderede koloniblanding blev derefter varmechokeret (80 liter C, 10 min), fortyndinger (101-106) blev set på 2 kg plader, og kolonier blev opregnet efter 30 timers inkubation (37 liter C) for at beregne antallet af varmebestandige kolonidannende enheder (cfu/koloni). Alle prøver blev udført som biologiske triplicater.

granuloseakkumuleringsassays blev udført via jodfarvning53. Mid-log fase (OD600 ~0,6) flydende kulturer (P2, 37 liter C) blev belagt på fast 2ksytg medium med forhøjede glukoseniveauer (50 g/L) for at muliggøre granuloseproduktion. Pladerne blev inkuberet ved 30 liter C til 4 dage, på hvilket tidspunkt de blev farvet ved udsættelse for en seng af jodkrystaller til 10 min. Pladerne fik derefter lov til at destain i 10 minutter før billeddannelse. Til kemisk komplementering af PKS i granuloseakkumuleringsassayet blev oprenset clostrienose (slutpladekoncentration 4,0 PKS) indlejret i faste 2 ksytg-plader inden plettering af PKS-kulturen. Da clostrienose blev tilsat til 2ksytg-plader som en koncentreret opløsning i methanol (blandet i det smeltede medie før størkning), blev det ækvivalente volumen methanol (6-liter) tilsat til alle andre 2ksytg-plader, der blev anvendt i granuloseakkumuleringsanalyserne til at kontrollere for denne virkning.

individuelle kolonier af C. acetobutylicum dyrket på CBM-plader i 48 timer (37 liter C) blev set og afbildet ved hjælp af et Leica MS16 F-dissekeringsmikroskop udstyret med et Leica dfc300-kamera.

oliespredningsassays blev udført som tidligere beskrevet76,77,78. I detaljer blev et 400 mL glasbæger (7,5 cm indvendig diameter) fyldt med 300 mL vand, og en 10 liter dråbe paraffinlampeolie blev tilsat og fik lov til at sprede sig i en tynd film på vandoverfladen over en 5 min periode (~25 mm i diameter). Opløsninger af surfactin, oprenset clostrienose og en kaliumphosphatbufferkontrol blev fremstillet ved den angivne pH og koncentration (fremstillet i 10 mM kaliumphosphatbuffer). Cirka 10 liter prøve blev omhyggeligt tilsat til midten af oliefilmen, og effekten på oliefilmen blev observeret. Prøver med overfladeaktivt stof forventes at danne stabile cirkulære clearingområder i oliefilmen, med mere potent overfladeaktivt stof aktivitet svarende til større clearingområder (eller fuldstændig dispersion af oliefilmen til meget høj overfladeaktivt stof aktivitet). Drop collapse assays blev udført77, 79, 80. Cirkulære mikrobølger (8 mm indvendig diameter) inden i polystyrenlåget på en 96-mikrobølgeplade (12,7 liter 8,5 cm) blev belagt med et tyndt lag paraffinlampeolie ved at tilsætte 2,0 liter paraffinlampeolie til hver brønd og lade dråben sprede sig jævnt over mikrobølgen over en periode på 1 time. Prøver af surfactin, oprenset clostrienose og kaliumphosphatkontrol blev fremstillet som til oliespredningsassays. Cirka 5 liter prøve blev omhyggeligt føjet til midten af mikrobølgen. Efter 5 minutter blev formen og graden af spredning af dråben observeret. Mens bufferkontroller forventes at danne stabile perler på mikrobølgeoverfladen, forventes prøver, der indeholder overfladeaktivt middel, at kollapse og sprede sig over mikrobølgeoverfladen med mere potent overfladeaktivt aktivitet svarende til en højere grad af dråbespredning.

oprensning og in vitro-analyse af PKS-protein

for at rense det His6-mærkede PKS-protein til in vitro-analyse blev pET24b_pks omdannet til E. coli BAP1. En enkelt koloni blev inokuleret i 10 mL LB + 50 kg/mL kanamycin (Kan) til vækst natten over ved 37 kg C. cirka 7 mL dyrkning natten over blev brugt til at inokulere 700 mL kg + 50 kg/mL Kan, og kulturen blev rystet ved 240 o / min og 37 kg C, indtil den nåede OD600 på 0,5. Efter isning af kulturen i 10 minutter blev isopropylthio-Kurt-d-galactosid (IPTG) tilsat til en endelig koncentration på 0.1 mM for at inducere proteinekspression, og kulturen blev inkuberet ved 16 liter C i 16 timer. cellerne blev høstet ved centrifugering (5500 liter g, 4 liter C, 20 minutter), resuspenderet i 25 mL lysisbuffer (25 mM HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM imidasol) og lyseret ved homogenisering over is. Celleaffald blev fjernet ved centrifugering (17.700 liter g, 4 liter C, 60 min), og Ni-NTA agaroseharpiks blev tilsat til supernatanten (2 mL/L kultur). Blandingen blev nuteret ved 4 liter C i 1 time, indlæst på en tyngdekraftstrømsøjle, og PKS-proteinet blev elueret med stigende koncentrationer af imidasol i Buffer a (20 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Oprenset PKS-protein blev koncentreret og buffer udvekslet til Buffer a + 10% glycerol under anvendelse af en Vivaspin Centrifugalkoncentrator. Alikvoter af renset PKS-protein blev alikteret og flashfrosset i flydende nitrogen. Det omtrentlige proteinudbytte var 5 mg / L (203 kDa).

et PKS-belastningsassay med 14C-mærket substrat indeholdt i et samlet volumen på 15 liter, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM CoA, 2-14C-malonsyre (0,1 liter), 10 liter MatB, 17 liter PKS og 50 mM HEPES, pH 8,0. Efter 2 h inkubation ved 25 liter C, prøver blev slukket ved tilsætning af et lige volumen på 1 liter SDS prøvebuffer. Efter SDS-SIDEANALYSE med en 4-15% gel (kriterium) blev gelen tørret i 2 timer ved 50 liter C og eksponeret på en lagerfosforskærm (20 liter 25 cm; molekylær dynamik) i 5 dage. Radioaktivt mærket protein blev afbildet på en Typhoon 9400 phosphorimager (Lagringsfosfortilstand, 50 liter opløsning; Amersham Biosciences).

for in vitro-produktanalyser (50 liter) af PKS-proteinet blev 8 liter PKS inkuberet med malonyl-CoA (2 mM) i phosphatbuffer (100 mM, pH 7,0) ved stuetemperatur i 2 timer for at generere forbindelse 4, identificeret ved sammenligning med en kemisk standard. NADPH (2 mM) blev tilsat til analysen for at generere forbindelser 5 og 6, som begge blev identificeret ved sammenligning med kemiske standarder. Efter inkubation blev analyseblandingerne ekstraheret to gange med 100 liter 99% ethylacetat/1% eddikesyre (v/v). De organiske ekstrakter blev tørret og resuspenderet i 100 liter methanol, og 10 liter blev injiceret på et Agilent Technologies 6120 Firpolet LC-MS (med DAD) instrument udstyret med en Agilent Eclipse Plus C18 søjle (4,6 liter 100 mm). En lineær gradient på 2-98% CH3CN (vol/vol) over 40 min i H2O med 0,1% myresyre (vol/vol) ved en strømningshastighed på 0,5 mL/min blev anvendt. LC-HRMS-analyse af assayekstraktionerne blev udført på et Agilent Technologies 6520-instrument med nøjagtig masse af LC-MS udstyret med en Agilent Eclipse Plus C18-søjle (4.6 100 mm) ved anvendelse af den samme opløsningsmiddelgradient og strømningshastighed som beskrevet ovenfor.

datatilgængelighed

RNA-sek data genereret i denne undersøgelse er blevet deponeret i Arrayekspress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) under tiltrædelsesnummer E-MTAB-6019. Alle andre relevante data er tilgængelige fra forfatterne efter anmodning.