ClpP protease aktivering resultater fra reorganiseringen af de elektrostatiske interaktionsnetværk ved indgangen porer

bindende tilstand af ACP1 til EcClpP

at belyse det strukturelle grundlag for clpp aktivering af ACP128, strukturer af NmClpP og EcClpP (Fig. 1a) i kompleks med ACP1 analoger blev søgt. Mens en struktur af NmClpP med bundet ACP1 ikke blev opnået på trods af gentagne forsøg, blev en struktur af EcClpP+ACP1-06-komplekset bestemt til 1,9 liter opløsning (Fig. 1b, C, tabel 1), der indeholder en tetradecamer i den asymmetriske enhed (kæder A-N). Elektrondensitet for N-terminale rester, der danner ecclpps aksiale sløjfer, er uklar i alle undtagen en underenhed (kæde B). I tidligere offentliggjorte strukturer er disse aksiale sløjfer meget fleksible og er normalt uordnet i krystallen i fravær af aktivatorer eller gennem udelukkelse ved krystalpakning23. Entydig elektrondensitet blev observeret for et enkelt ACP1-06 molekyle i en lomme dannet af underenheder D og E, der viser to forskellige konfigurationer af forbindelsen (Fig. 2a, b). Begge konfigurationer blev modelleret i elektrondensiteten, hvor den første konfiguration placerer trifluormethylpyridindelen af forbindelsen i en hydrofob lomme (nedkonfiguration), mens den anden placerer den ud af den hydrofobe lomme udsat for opløsningsmiddel (op-konfiguration) (Fig. 2a). De resterende 13 hydrofobe lommer viser tvetydig elektrondensitet for ACP1-06. Vi modellerede og raffinerede alle 14 ACP1-06 molekyler i både op og ned konfigurationer ved belægning på 0,5, hvilket resulterede i forbedret elektrondensitet for hver ligand.

bindingsmetoderne for ACP1 – 06 (Fig. 2B-d) tilnærmelsesvis de af ADEPs observeret i krystalstrukturer af forskellige bakterielle Clpp ‘ er (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Bemærk, at forbindelser syntetiseret af vores gruppe er nummereret som ACP1-YY og ADEP-YY, mens forbindelser fra undersøgelser fra andre grupper er navngivet som i de respektive offentliggjorte papirer. Alle proteinkontakter med ACP1 – 06 er ikke-polære bortset fra to bemærkelsesværdige elektrostatiske bindinger, der forekommer mellem (1) Den phenolhydroksyl sidekæde af Y76 og amid ilt af ACP1-06 og (2) guanidinyl sidekæde af R206 (den næstsidste Arg i EcClpP) og et sulfonyl ilt af ACP1-06 (Fig. 2b). De to sidstnævnte interaktioner er til stede i begge konfigurationer af ACP1-06. Derudover stabiliseres R206 (kæde E) ved ionisk binding med E65 af en tilstødende underenhed (kæde D) (Fig. 3a, b).

i nedkonfigurationen optager trifluormethylpyridindelen af ACP1-06 et hydrofobt hulrum dannet af L62, T93 og F96 (kæde D) og Y74, Y76, I104, L203 og L128 (Kæde e) (Fig. 2b og 3b). Dette er det samme hulrum besat af ringen af den eksocykliske Phe-rest af de forskellige ADEP-analoger, der er omkrystalliseret med ClpP, såsom i vores NmClpP+ADEP-0419 (Fig. 2e, f) eller ecclpp + ADEP1 strukturer40 (Fig. 2c, d). I modsætning hertil drejes trifluormethylpyridindelen i op-konfigurationen rundt om C – s-bindingen og udsættes for opløsningsmiddel, mens van Der-kontakter med Y74, i104, F126 og L203 (Kæde e) (Fig. 2b og 3b). Gem-dimethyldelen stabler mod den flade ring af Y74 (kæde E), mens den udvidede alifatiske kæde, der slutter med en ortho-chlor-substitueret phenylring, sidder i en ikke-polær rille mellem to spiraler fra tilstødende underenheder (Fig. 3b). Denne bindende kløft er dannet af L62 (kæde D), F63 (kæde D), A66 (kæde D), L37 (Kæde E), V42 (kæde E) og den ikke-polære del af E40 (Kæde e) (Fig. 2b og 3b).

i både ACP1-06 – og ADEP1-bundne strukturer af EcClpP findes intrasubunit saltbroen mellem R36 og E40, hvor den nærliggende alifatiske hale af ADEP1 eller den chlorsubstituerede phenylring af ACP1-06 danner en hydrofob interaktion med sidekæden af E40 (Fig. 3b, c). De to aktivatorer stabiliseres yderligere på det hydrofobe sted ved hjælp af to forskellige hydrogenbindingsmønstre. Mens ACP1 – 06 er sikret gennem en opløsningsmiddeleksponeret ionisk interaktion mellem dens sulfonylgruppe og den C-terminale r206-rest (Fig. 3B), holdes ADEP1 på plads af to hydrogenbindinger med den hydroksylgruppe af Y76, der er afsondret inden for det hydrofobe sted (Fig. 3c). En opløsningsmiddelmedieret hydrogenbinding mellem E65 og carbonylgruppen i n-acyl Phe-sidekæden af ADEP1 styrker yderligere dens interaktion med EcClpP (Fig. 3c). Denne ekstra hydrogenbinding såvel som den større størrelse af den cykliske depsipeptidring, som har mere overfladeareal til dannelse af Van Der-interaktioner sammenlignet med den mindre trifluormethylpyridingruppe af ACP1, kan tegne sig for den generelt strammere binding, der observeres for ADEPs end ACP1s28.

i EcClpP+ACP1-06-strukturen fandt vi en uforklarlig elektrondensitet i alle 14 underenheder, der strækker sig fra den nukleofile rest S111 af den katalytiske triade, hvilket antyder en kovalent modifikation (supplerende Fig. 1a, b). Tætheden strækker sig i omtrent rette vinkler i modsatte retninger væk fra s111-sidekæderne. På trods af omfattende indsats kunne det ikke overbevisende udstyres med peptider, acylketonprodukter eller forskellige kendte serinproteasehæmmermolekyler.

Bindingstilstand for ADEP til NmClpP

NmClpP har en kortere pro-sekvens ved N-terminalen, mens den har fire ekstra rester ved C-terminalen sammenlignet med EcClpP (Fig. 1a). Selvom NmClpP blev udtrykt som et protein i fuld længde, der bærer en N-terminal His6-tag, observerede vi gentagne gange manglende binding til ni-nitrilotrieddikesyreharpiks. N-terminal sekventering af det oprensede protein afslørede, at den modne NmClpP starter ved rest Y6 (Fig. 1A), hvilket indikerer autoproteolyse for at frigive sin N-terminale pro-sekvens (1msfdn5).

tidligere havde vi bestemt strukturen af NmClpP med ADEP-0419. I denne undersøgelse bestemte vi strukturen af apo-NmClpP til 2,0 liter og NmClpP med bundet ADEP-14 til 2,7 liter (Fig. 1b, c, supplerende Fig. 1C, tabel 1). Strukturen af apo-NmClpP indeholder en tetradecamer i den asymmetriske enhed og viser ingen klar densitet for nogen af de 14 N-terminale aksiale sløjfer. Der observeres svag elektrondensitet for de sløjfer, der dannes af rester G133-G137 i streng lars8 i håndtagsområdet (Fig. 1a). Den asymmetriske enhed til nmclpp + ADEP-14 krystal indeholder to tetradecamers (supplerende Fig. 1d). Der blev ikke observeret nogen elektrondensitet for rester 1-22 af alle 28 underenheder på grund af krystalpakning (Fig. 1C, supplerende Fig. 1d). Hertil kommer, at prist8-strengen (rester 130-137; Fig. 1a) er kun delvist synlig i alle underenheder. ADEP-14 er bundet til NmClpP i en lignende konfiguration som ADEP-04 (Fig. 2e, f og 3e, f). Kort fortalt indtager difluorophenyldelen af ADEP-14 en hydrofob lomme dannet af Y67, L95, L97 og L119 af en underenhed og V49, L53, T84 og F87 af en tilstødende underenhed (Fig. 3e). Den seksledede ring af pipecolsyre-delen er eksponeret for opløsningsmiddel og stabiliseres af phenylringen på F117 og de hydrofobe sidekæder på L97, L119 og L196 (Fig. 3e). Den yderligere methylsubstitution på allo-threoninresten i depsipeptidringen (Fig. 1b) er udsat for opløsningsmiddel. Ligesom ADEP-04 er ADEP-14 sikret i den stærkt komplementære hydrofobe lomme ved to hydrogenbindingsinteraktioner mellem den phenolhydroksylgruppe af Y67, aminogruppen af difluorphenylalaninresten og alanincarbonylgruppen i depsipeptidringen og en opløsningsmiddelmedieret hydrogenbinding med E56 (Fig. 3e, f). Octadiensyre-sidekæden af ADEP-14 er placeret i den smalle hydrofobe kanal dannet af L53, F54 og S57 af en underenhed og R27, L28, E31, I33, F35 og Y67 af den nærliggende underenhed (Fig. 3e).

ACP1 – og ADEP-binding resulterer i forskellige allosteriske effekter på ClpP – tønden

ved hjælp af strukturer af apo-og sammensatte bundne former for EcClpP og NmClpP (Fig. 1c), undersøgte vi de allosteriske effekter, der opstår ved aktivatorbinding. Som vist i supplerende Fig. 2 virker aktivatorbinding som en kil, der forårsager lateral forskydning af to tilstødende underenheder. Omfanget af global konformationsændring forårsaget af ACP1 – 06-binding (rmsd = 0,84 liter i forhold til apo-EcClpP) svarer til det for ADEP-04 (rmsd = 0.73 liter i forhold til apo-NmClpP), men mindre end for ADEP-14 (rmsd = 2,47 liter i forhold til apo-NmClpP). Interessant nok er forskydningsretningen forskellig mellem de to klasser af aktivatorer (supplerende Fig. 2 og supplerende Film 1-4). Mellem de to aDep ‘ er forårsager ADEP-14 en større samlet strukturel forstyrrelse af nmclpp-cylinderen (sammenlign supplerende film 3 vs. 4). ADEP-binding resulterer i en udvidelse af den apikale overflade af NmClpP ledsaget af indsnævring i ækvatorialområdet. Drejetappen for denne bevægelse er i håndtagsregionen sammensat af spiral aE og streng kurp8. Dette fænomen observeres i alle ADEP-bundne ClpP-strukturer, der hidtil er kendt,med varierende grad af komprimering af ClpP-cylinderen15,18,19,23, 40. I modsætning hertil forårsager ACP1 – 06 binding til EcClpP en indadgående bevægelse af alle underenheder, hvilket resulterer i stramning af ClpP-cylinderen (supplerende film 1). Strukturerne viser således, at ACP1s og ADEPs aktiverer ClpP ved at inducere forskellige allosteriske effekter.

i de aktivatorbundne EcClpP-og nmclpp–strukturer forbliver de ring-ringgrænseflade elektrostatiske bindinger, der stabiliserer tetradecamer, bevaret på trods af konformationsændringer (supplerende Fig. 3). På trods af den globale strukturelle ændring ved aktivatorbinding opretholder Ser-His-Asp katalytiske triader af EcClpP og nmclpp desuden katalytisk kompetente geometrier, da kun mindre ca-rygradskift forekommer nær det aktive sted (supplerende Fig. 1a-c). Analyse af alle eksisterende ACP1 – og ADEP-bundne strukturer af ClpP viser, at forbindelsesbinding også resulterer i sammentrækning af ækvatorialområdet (supplerende Fig. 4).

vi kvantificerede komprimeringen af ClpP-cylinderen ved ACP1-eller ADEP-binding ved at måle volumenerne af de respektive katalytiske kamre (supplerende Fig. 4). ACP1 – 06 binding forårsager et ~5% fald i det katalytiske kammervolumen i forhold til apo-EcClpP. ADEP1-binding til EcClpP resulterer i et lignende fald i katalytisk kammervolumen. Dette observeres også for andre aktivatorbundne ClpP-strukturer, såsom ADEP-14-bundet NmClpP, ADEP-bundet BsClpP og det ADEP-bundne MtClpP1P2 heterooligomere kompleks (supplerende Fig. 4).

ClpP-aktivering resulterer i omorganiseringen af det elektrostatiske bindingsnetværk ved de aksiale porer

i strukturen af apo-nmclpp stabiliserer to elektrostatiske bindinger nær den aksiale pore grænsefladen for to tilstødende underenheder (Fig. 3D, supplerende Fig. 5). For det første danner den negativt ladede E58 carboksylat-gruppe af en underenhed et ionpar med den positivt ladede R27 guanidiniumgruppe af den tilstødende underenhed. For det andet danner S57-og E31-carboksylat-grupperne af to tilstødende underenheder en hydrogenbinding. Ved ADEP-binding brydes disse to ikke-kovalente bindinger, mens den ioniske binding mellem R27 og E31 af den samme underenhed forkortes, dvs.styrkes (Fig. 3e, f). I apo-EcClpP forbinder kun en ionbinding mellem E67 og R36 to tilstødende underenheder, da den ækvivalente rest til S57 af NmClpP er en alanin i EcClpP og således ikke er i stand til at danne en hydrogenbinding med E40 (Fig. 3a). Som i NmClpP eliminerer binding af ACP1 eller ADEP1 til EcClpP intersubunit E67-R36 ionbinding og giver anledning til en stærkere intrasubunit ionbinding mellem R36 og E40 (Fig. 3b, c, supplerende Fig. 5).

for yderligere at verificere disse observationer designede vi nmclpp og EcClpP point mutanter, der fører til tab af ovennævnte intersubunit elektrostatiske bindinger. Som vist i Fig. 4a, mens NMCLPP ikke var i stand til at nedbryde proteinkaseinet, blev nmclpp E58A-mutanten fundet at nedbryde kasein med en højere hastighed end e31a-mutanten. Det er vigtigt, at dobbeltmutanten E31A + E58A havde en endnu højere aktivitet end de enkelte mutanter. Omfanget af aktivering af den dobbeltmutante NmClpP svarer til den, der observeres i nærvær af 1 liter adeps eller 10 liter ACP1s (Fig. 4a). Lignende adfærd blev observeret for EcClpP med lignende mutationer (E40A og E67A; Fig. 4b). Den respektive ecclpp dobbeltmutant er ikke opløselig og kunne ikke testes.

derefter bestemte vi Røntgenstrukturer af nmclpp E58A og nmclpp E31A + E58A mutanter (tabel 1). De katalytiske steder i begge mutanter forstyrres ikke (supplerende Fig. 1e). I nmclpp E58A enkelt mutant, mutationen afskaffer intersubunit E58–R27 ionbinding og giver anledning til en stærkere intrasubunit R27-E31 interaktion, mens hydrogenbindingen mellem S57 og E31 forbliver (Fig. 4c). En lignende “kileeffekt” observeres således i strukturen, som vist ved den subtile globale konformationsændring i nmclpp-mutantens Ca-rygrad (rmsd = 0,33 liter i forhold til vægt NmClpP) (supplerende film 5). Mutation af både E31 og E58 til alanin for at generere den dobbelte mutante NMCLPP E31A + E58A (rmsd = 0,29 liter i forhold til vægt NmClpP) afskaffer de to stabiliserende intersubunit elektrostatiske interaktioner såvel som intrasubunit R27–E31 ionbinding til stede i NmClpP E58A enkelt mutant (Fig. 4D og supplerende Film 6) og i ADEP-bundet NmClpP (Fig. 3e, f). Således er nmclpp E31A + E58A dobbeltmutant i modsætning til ADEP-bundet NmClpP med den eliminerede intrasubunit ionbinding, men er ikke desto mindre et aktiveret protein med iboende proteolytisk aktivitet, der kan sammenlignes med den for lille molekyle-aktiveret ClpP (Fig. 4a). Ligesom ADEP-bundet NmClpP har både nmclpp enkelt-og dobbeltmutanter reduceret katalytiske kammervolumener på grund af clpp-tøndekomprimering (supplerende Fig. 4).

en sådan omorganisering af bindingsnetværket observeres for alle aktiverede ClpP-strukturer, der er tilgængelige i FBF, hvad enten det er i nærvær af småmolekyleaktivatorer eller på grund af specifikke mutationer (supplerende Fig. 6). For eksempel lille molekyle aktivator binding til B. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), M. tuberculosis ClpP (MtClpP) og Homo sapiens ClpP (HsClpP) afskaffer en eller to intersubunit elektrostatiske bindinger nær den aksiale pore og giver anledning til en stærkere, intrasubunit ionisk interaktion (supplerende Fig. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. I MtClpP2 eksisterer intersubunit ionbindingen svarende til E58-R27 interaktionen i NmClpP ikke18. Den ækvivalente rest for E58 af NmClpP er L66 i MtClpP2 og er ude af stand til at deltage i en ionisk interaktion med K35 af MtClpP2 (svarende til R27 af NmClpP). I stedet stabiliserer en intersubunit hydrogenbinding mellem S65 og E39 grænsefladen (supplerende Fig. 6g, h). ADEP binding til MtClpP2 bryder S65-E39 hydrogenbindingen og styrker intrasubunit ionbindingen mellem K35 og E3918.

interessant nok understøtter selv den aktiverede SaClpP Y63A-variant41 med den aktiverende mutation, der findes i midten af det hydrofobe sted, og derfor ikke svarer til de aktiverende mutationer af NmClpP, der præsenteres her, vores foreslåede model for omorganisering af hydrogenbindingsnetværket omkring den aksiale pore ved ClpP-aktivering (supplerende Fig. 6f). I strukturen af SaClpP Y63A-mutanten øges afstanden mellem intersubunitionparet (Kv54–R23), mens intrasubunit–saltbroen (R23-D27) styrkes (supplerende Fig. 6d, f). Vi genererede også den tilsvarende Y63A-mutation i både EcClpP og nmclpp. Nmclpp Y67A-mutanten var uopløselig, mens EcClpP Y76A havde en aktivitet lidt højere end e40a-mutanten, men lavere end E67A-mutanten (Fig. 4b).

ClpP-aktivering resulterer i reduktion i strukturel heterogenitet af de N-terminale aksiale sløjfer

som beskrevet ovenfor frigiver ADEP–bindingen R27 fra en intersubunit ionbinding med E58 og styrker intrasubunit ionbinding med E31 af spiral aA (Fig. 5a). Følgelig danner R27 en ionbinding med D23 af streng lyr1 af den aksiale sløjfe. Denne stabiliserende interaktion observeres i alle aktivatorbundne strukturer af ClpP, hvor de aksiale sløjfer er ordnet (Fig. 5a-e).

for EcClpP + ACP1–06-strukturen er de aksiale sløjfer (rester 14-31) delvist ordnet i krystallen med kun 1 ud af 14 aksiale sløjfer, der danner prip1-prip2 hårnålesving (Fig. 1C-komplet bestilling ser ud til at være delvist forhindret af krystalpakningseffekter). I den ordnede aksiale sløjfe af underenhed a, frigivelse af R36 fra intersubunit ionbinding med E67 gør det muligt at danne en stærkere intrasubunit ionbinding med E40 af spiral aA (Fig. 5f). Der er imidlertid ingen stabiliserende ionisk interaktion mellem E22 af streng lyr1 og R36 af spiral aA, sandsynligvis på grund af delvis bestilling (Fig. 5f). En yderligere hydrogenbinding mellem D32 af streng lus2 og S21 af spiral aA forankrer den aksiale sløjfe til EcClpP-kernedomænet (Fig. 5f). Tilsvarende er de aksiale sløjfer i Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4-strukturen kun delvist ordnet21. Den konserverede hydrogenbinding mellem Arg-remanensen af spiralformet aA og en negativt ladet rest af streng lus1 ses ikke i de delvist ordnede efclpp aksiale sløjfer, skønt EfClpP har potentielle hydrogenbindingsdannende rester på streng lus1 (T6) og på sløjfeforbindelsesstrengene lus1 og lus2 (E9, 10.kvartal, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

ud over konserverede elektrostatiske interaktioner stabiliserer omfattende hydrofobe kontakter med ClpP-hoveddomænet de aksiale sløjfer. I EcClpP + ACP1-06 deltager ikke-polære N-terminale rester af streng lars1 og den foregående strukturerede spole i hydrofobe interaktioner med ikke-polære rester af spiral aA af den samme underenhed og på de hydrofobe flader af helices aA’ og aB’ af en nærliggende underenhed (supplerende Fig. 7a). De ikke-polære rester på helices aA, aB’ og lars3′ udgør et kontinuerligt hydrofobt plaster på omkredsen af den aksiale pore (supplerende Fig. 7b) 15.

for at få et klarere billede af den konformationelle heterogenitet af ClpP-aksiale sløjfer blev methyl-TROSY NMR-eksperimenter derefter udført. Oprindeligt blev en enkelt cysteinmutation introduceret i de aksiale sløjfer af NmClpP(T10C). Ensartet deutereret protein blev produceret og efterfølgende omsat med 13C-methyl-methanthiosulfonat (MMTS). Dette resulterer i fastgørelse af en enkelt NMR synlig 13ch3–s-gruppe til cysteinsidekæden, hvilket fører til dannelse af en s-methylthio-cystein (MTC) rest42. Denne metode giver en let måde at overvåge strukturen og dynamikken i store komplekser i opløsning. Ved at overvåge NMR-korrelationerne af den vedlagte spin-probe i frie, aktivatorbundne eller muterede former af den aksiale pores opløsning giver man en aflæsning af de aksiale porers opløsningskonformation.

oprindeligt blev der udført kontroleksperimenter for at sikre, at introduktionen af t10mtc-delen ikke forstyrrer strukturen af nmclpp. Kort fortalt 1h-13C heteronuklear multiple kvantekohærens (hmkc) korrelationer af vægt og T10MTC NmClpP mærket 13ch3 ved sidekæden af ILVM-rester i en ellers fuldt deutereret baggrund blev sammenlignet og fundet at være næsten identiske. Efterfølgende blev 1h-13C hmkc korrelationer af NmClpP T10MTC opnået i forskellige tilstande (Fig. 6a). Apo-formen (blå konturer) har et stort antal korrelationer, hvilket indikerer strukturelt heterogene aksiale sløjfer. Tilsætning af to gange molært overskud af ADEP-28 (aktivitet givet i Fig. 4a) over monomer ClpP reducerede signifikant antallet af korrelationer (røde konturer), hvilket indikerer stivgørelse eller strukturel rækkefølge. I modsætning hertil acp1-17 binding (to gange molært overskud over monomer ClpP; aktivitet givet i Fig. 4a) resulterer i ikke-detekterbare ændringer i de observerede korrelationer (grønne konturer), hvilket antyder, at de aksiale sløjfer ikke påvirkes.

denne tilgang blev også udnyttet til at overvåge effekten af aktiverende mutationer (Fig. 4a, b) på de aksiale sløjfer. I disse eksperimenter blev de aktiverende mutationer introduceret i baggrunden af t10c (mærkning) mutationen. Som vist i Fig. 6a, korrelationer af nmclpp T10MTC/E31A-mutanten (røde konturer) er lidt mindre heterogene end pseudo-VÆGTFORMEN, mens de af nmclpp T10MTC/E58A-mutanten (orange konturer) er næsten uændrede. Den samtidige tilstedeværelse af begge aktiverende mutationer (NmClpP T10MTC/E31A + E58A) har en meget mere dramatisk effekt end enkeltmutationer og fjerner et stort antal korrelationer svarende til de aksiale sløjfer (sorte konturer). Dette er i overensstemmelse med observationen om, at dobbeltmutanten er mere aktiv end de enkelte mutanter (Fig. 4a).

ClpP-aktivering resulterer i reduktion i konformationel heterogenitet i håndtagsregionen

den samme NMR-baserede tilgang blev brugt til at undersøge effekten af aktivatorbinding og mutationer på håndtagsregionen. En i144mtc (spiral aE) mutant af NmClpP blev fremstillet og undersøgt af NMR i apo-, ADEP-28-og ACP1-17-bundne former. Apo-formen (blå konturer, Fig. 6a) udviser et par toppe, hvilket indikerer, at håndtagsområdet er forbundet med et par sameksisterende konformationer, som det ses i vores tidligere arbejde med EcClpP4. Interessant nok fører tilsætning af ACP1 og ADEP til forsvinden af en af toppe. I betragtning af at aktivatorbindingsstedet er distalt til NMR-spin-sonden, ser det ud til, at ACP1 eller ADEP-binding allosterisk vælger for en af konformationerne i håndtagsområdet. Alternativt kan aktivatorer muligvis binde begge former, men inducere en ændring til en enkelt tilstand.

Magnetiseringsudvekslingseksperimenter med blandingsforsinkelsesperioder af 100, 200, 300, 400, 500, og 600 ms ved 40 C var ude af stand til at detektere nogen interkonversion mellem konformerne observeret for håndtagsområdet for vægt NmClpP. Dette indikerer, at udvekslingsprocessen er for langsom til karakterisering af NMR.

SACHSER demonstrerer aktivatorinducerede ClpP-konformationsændringer i opløsning

for yderligere at undersøge den oligomere tilstand og strukturelle ændringer ved sammensat binding blev apo-NmClpP og NmClpP+ADEP-04 prøver karakteriseret ved SACHSER (Fig. 6b-g og supplerende Fig. 8). Endelige flettede kurver er vist i Fig. 6b, og de opnåede sachser-profiler lignede dem med hule strukturer43. Der blev ikke fundet signifikante ændringer med hensyn til samlet foldning (supplerende Fig. 8), gyrationsradius (Rg) og oligomer tilstand, når ADEP-04 blev sat til nmclpp (supplerende Fig. 8c). For yderligere at analysere nmclpp Sachs profiler og generere løsning ab initio strukturer, GNOM-programmet blev brugt til at konstruere pardistancefordelingsfunktioner, p(r). Apo-NmClpP p(r) afslørede en subtil højre skift og større maksimal dimension (DMAKS) sammenlignet med ADEP-04-bundet NmClpP (Fig. 6c og supplerende Fig. 8c). Derefter blev dummy atom-modeller (dæmninger) genereret ved hjælp af Sachs-data til visuelt at analysere nmclpp-opløsningsstrukturer (Fig. 6d-g). Ti modeller blev genereret til apo-NmClpP og ADEP-04-bundet NmClpP, og de mest sandsynlige blev valgt. Disse modeller viste, at de to nmclpp-opløsningsstrukturer generelt er ens (hule cylindre). Når de blev overlejret med de tilsvarende krystalstrukturer, blev der imidlertid let observeret forskelle, der stemmer overens med højopløsningsstrukturerne (Fig. 6d, e). Et mål for de aksiale højder af alle ti dæmninger for apo – og ADEP-04-bundet NmClpP resulterede i værdier på 93,0 liter 5,4 liter for apo-formen og 103,5 liter 6,1 liter for den ADEP-04-bundne form. For yderligere at bekræfte denne observation, gennemsnitlige dæmninger sandsynlighedskort og højeste das-belægningskort (Fig. 6f, g) blev analyseret. De aksiale højder viste en stigning på omkring 10 liter for ADEP-04-bundet NmClpP i sammenligning med apo-nmclpp. Desuden viste ADEP-04-bundet NmClpP en større aksial poreomkreds end apo-nmclpp (Fig. 6f, g). På trods af den lave opløsning af Sachs-teknikken antyder resultaterne således, at ADEP-04-binding til nmclpp ikke påvirker den oligomere tilstand af NmClpP, men forårsager en udvidelse af de aksiale porer og øget belægning i de øverste og nederste dele af NMCLPP+ADEP-04-dæmningen (Fig. 6e, g) sammenlignet med apo-NmClpP. Dette afspejler sandsynligvis de konformationsændringer, der fører til den nedsatte heterogenitet af strukturen af de N-terminale aksiale sløjfer af NmClpP observeret ved røntgen og NMR.