Clemisol og modulatorer af serotoninsignalering undertrykker anfald i Dravet syndrom

abstrakt

Dravet syndrom er en katastrofal barndomsepilepsi med anfald i begyndelsen, forsinket sproglig og motorisk udvikling, søvnforstyrrelser, angstlignende adfærd, alvorligt kognitivt underskud og en øget risiko for dødsfald. Det er primært forårsaget af de novo mutationer af SCN1A-genet, der koder for en neuronal spændingsaktiveret natriumkanal. Sebrafisk med en mutation i SCN1A-homologen rekapitulerer spontan anfaldsaktivitet og efterligner de krampagtige adfærdsbevægelser, der er observeret i Dravet syndrom. Her viser vi, at fænotypisk screening af lægemiddelbiblioteker i sebrafisk scn1-mutanter hurtigt og med succes identificerer nye terapeutiske midler. Vi demonstrerer, at clemisol binder til serotoninreceptorer, og dets antiepileptiske aktivitet kan efterlignes af lægemidler, der virker på serotoninsignaleringsveje, f.eks. Vi behandlede fem medicinsk uhåndterlige Dravet-syndromspatienter med en klinisk godkendt serotoninreceptoragonist (lorcaserin, belvik) og observerede nogle lovende resultater med hensyn til reduktioner i anfaldsfrekvens og/eller sværhedsgrad. Vores resultater viser en hurtig vej fra præklinisk opdagelse i sebrafisk, gennem målidentifikation, til potentielle kliniske behandlinger for Dravet syndrom.

introduktion

barndomsepilepsier klassificeret som katastrofale er ofte forbundet med en genetisk mutation. Blandt disse har Dravet syndrom været forbundet med mere end 600 de novo mutationer i et enkelt gen, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). Børn, der lider af Dravet syndrom, udviser anfald, der starter så tidligt som 6 måneder, forsinket sprog-og motorudvikling, søvnforstyrrelser, angstlignende adfærd og alvorligt kognitivt underskud (Dravet, 2011). Symptomer på autismespektrumforstyrrelse er også rapporteret (Li et al., 2011) og risikoen for pludselig uforklarlig død med epilepsi (SUDEP) i denne population anslås til 15 gange højere end andre epilepsier i barndommen (Kearney, 2013). Tilgængelige antiepileptika tilbyder ikke tilstrækkelig anfaldskontrol, og resektive neurokirurgiske procedurer er ikke almindeligt en mulighed. Nye behandlinger for Dravet syndrom er fortsat et vigtigt udækket behov på trods af en vis grad af effektivitet i begrænsede kliniske forsøg med cannabidiol (Diacomit) og stiripentol (Diacomit), som kan være forbundet med henholdsvis kognitive eller appetitsikkerhedsproblemer (Peres et al., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

mutationer i SCN1A, et gen, der koder for den poredannende LARP-underenhed af en spændingsgated natriumkanal (Nav1.1), er blevet identificeret hos næsten 85% af patienterne med Dravet syndrom (Dravet, 2011). Nav1.1-kanaler bidrager til hurtig depolarisering af neuronale membraner set under aktionspotentialgenerering (Hodgkin et al., 1952). Mus heterosygøse for en tab af funktionsmutation i Nav1.1 Udvikler spontane og temperaturfølsomme anfald tidligt i livet og dør for tidligt omkring postnatal dag 25 (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Akutte elektrofysiologiske undersøgelser i disse og relaterede scn1a-mangelfulde mus antyder en reduktion i natriumstrømtæthed og et associeret fald i fyringsaktiviteten for en subpopulation af GABA-ekspressive hæmmende neuroner (men ikke ophidsende hovedceller), der kulminerer med reduceret synaptisk inhibering og netværkshypereksibilitet (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Denne’ interneuronopati ‘ – hypotese er i overensstemmelse med andre former for katastrofale epilepsier hos børn og blev bekræftet hos mus, hvor Scn1a selektivt blev slettet fra parvalbumin – eller somatostatin-ekspressive interneuron-subpopulationer (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Autistisk-lignende adfærd blev også rapporteret i disse mus (Han et al., 2012). Interessant nok rapporterede indledende undersøgelser af humane ophidsende og hæmmende neuroner afledt ved hjælp af induceret pluripotent stamcelleteknologi fra to patienter med Dravet syndrom underskud i spændingsaktiveret natriumstrøm for begge celletyper, hvilket antyder enten homeostatisk kompensation for det tidlige tab af funktion af en kritisk hjernespecifik natriumkanal eller yderligere mekanismer, der bidrager til den epileptiske fænotype observeret hos disse patienter (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

selvom mus og humane inducerede pluripotente stamcelleafledte neuroner bidrager til vores forståelse af den underliggende patofysiologi af Dravet syndrom, er disse systemer ikke velegnede til hurtig identifikation af nye terapier på grund af variabiliteten af disse modeller og reproducerbarhed af kvantitative målinger. Som sebrafisk er et ideelt hvirveldyr model system til udførelse af små molekyle fænotype-baserede skærme (MacRae et al., 2015), og er modtagelige for genetiske manipulationer, fokuserede vi vores indsats på en sebrafisk natriumkanalmutant. Sebrafiskmutanter, der huser en tab af funktion missense-mutation i SCN1A-ortologen, scn1Lab, blev identificeret i en mutageneseskærm (Schoonheim et al., 2010). På grund af en forfædres helgenomduplikation er sebrafisk scn1Lab− mutanter haploinsufficient for Nav1.1 og analog med Scn1a+/ – mus eller patienter med Dravet syndrom. Konvulsiv adfærd og episoder med kort interictal og langvarig polyspike ictal-lignende elektrografisk udledning observeres i mutante larver så tidligt som 3 dage efter befrugtning (dpf) med progression til mere robuste anfaldsfænotyper mellem 4 og 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). Mutantlarver dør for tidligt, udviser metaboliske underskud (Kumar et al., 2016), og er resistente over for mange antiepileptika (AED ‘ er) (Dinday et al., 2015). I lighed med den kliniske behandling af Dravet-syndrom kan der opnås en vis dæmpning af anfaldsaktivitet med valproat, bromider, stiripentol samt en ketogen diæt (Baraban et al., 2013). Ved hjælp af scn1Lab mutant sebrafisk larver og en to-trins fænotype-baseret screeningsstrategi har vi nu screenet mere end 2300 forbindelser. Clemisol, en første generations histaminreceptor (H1) antagonist, blev identificeret som en potent hæmmer af adfærdsmæssig og elektrografisk anfaldsaktivitet (Baraban et al., 2013). Antihistaminer er imidlertid kontraindiceret i pædiatriske epilepsipopulationer (Miyata et al., 2011) og H1-receptoranalogen i sebrafisk viser mindre end 50% lighed med mennesker (Peitsaro et al., 2007). Her bruger vi prækliniske sebrafiskmodeller til at demonstrere, at clemisol, men ikke antihistaminer, udøver antiepileptisk aktivitet. På basis af ligandbinding og yderligere målrettet lægemiddelscreening i scn1 mutant sebrafisk identificerede vi flere serotonin (5-HT) modulatorer som effektive til at undertrykke anfald, herunder to FDA-godkendte forbindelser. Lorcaserin blev ordineret til børn med Dravets syndrom under et program for anvendelse med særlig udleveringstilladelse og resulterede i nedsat anfaldsaktivitet hos nogle patienter. Vi foreslår, at modulering af 5-HT-signalering repræsenterer en ny terapeutisk intervention for denne katastrofale barndomsepilepsi.

materialer og metoder

vedligeholdelse af Sebrafisk

beslaglæggelse overvågning

ved 5 dpf individuelle sebrafisk larver blev anbragt i en enkelt brønd af en klar fladbundet 96-brønd mikroplade indeholdende embryomedier. Larver blev udvalgt tilfældigt, da kønsbestemmelse ikke er mulig på dette stadium. Mikroplader blev anbragt inde i DanioVision bevægelsessporingsenhed og akklimatiseret i 20 minutter ved stuetemperatur. Locomotion plots blev opnået for hver brønd under en optagelsesepoke på 10 minutter ved hjælp af et DanioVision-system, der kører Ethovision-program (DanioVision, Noldus Informationsteknologi); tærskeldetekteringsindstillinger for at identificere objekter, der er mørkere end baggrunden, blev optimeret til hvert eksperiment. Beslaglæggelse scoring blev udført under anvendelse af følgende tre-trins skala etableret for pentylentetrasol-inducerede anfald (Baraban et al., 2005): fase 0, ingen eller meget lidt svømmeaktivitet; fase i, øget, korte anfald af svømmeaktivitet; Fase II, hurtig ‘boblebadlignende’ cirklende svømmeadfærd; og fase III, paroksysmal klonuslignende kramper i hele kroppen og et kort tab af kropsholdning. Vildtype fisk er normalt scoret på Trin 0 eller I. Parceller blev analyseret for tilbagelagt afstand (i millimeter) og gennemsnitshastighed (i millimeter pr.sekund). Som rapporteret tidligere (vinter et al., 2008; Baraban et al., 2013), hastighedsændringer var den mest følsomme analyse af anfaldsadfærd.

til elektrofysiologiske undersøgelser blev sebrafisklarver kortvarigt lammet med kur-bungarotoksin (1 mg/ml) og immobiliseret i 1,2% agarose; lokale feltpotentielle optagelser blev opnået fra forhjernestrukturer ved hjælp af en enkeltelektrodeteknik, som tidligere beskrevet (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Agarose-indlejrede lokale feltpotentielle optagelsessessioner på 10 til 30 min blev opnået for hver fisk ved 1 KHS. Isap-systemet (Hong et al., 2016) blev brugt til langvarig ikke-invasiv overvågning af sebrafisk i fravær af et lammende middel. Systemet fælder autonomt flere sebrafisklarver under flere integrerede overfladeelektroder i de mikrofluidiske kamre. scn1Lab larver blev kontinuerligt overvåget i 5 timer. elektrisk feltpotentiale blev registreret ved 1 KHS kontinuerligt undtagen 2-til 3-min pauser til medieændring til sammensat behandling og vask. De registrerede data blev analyseret ved hjælp af MATLAB til feltpotentialegrafer og frekvensanalyse.

sammensat biblioteksscreening

forbindelser til lægemiddelscreening blev købt fra Selleck Chemicals og blev leveret som 10 mM DMSO-opløsninger. Sellecks Ion Channel Ligand Library (katalog #L2700), GPCR Compound Library (katalog #L2200) og et tilpasset 5-HT modulerende bibliotek blev brugt til screening. Biblioteksforbindelser er anført i supplerende tabel 1. I alle lægemiddelbiblioteksskærme blev forbindelser kodet, og eksperimenter blev udført af efterforskere, der var blinde for forbindelsens natur. Baseline-optagelser af bevægelsesadfærd blev opnået fra mutanter i embryomedier som beskrevet ovenfor; et andet bevægelsesplot blev derefter opnået efter en opløsningsændring til en testforbindelse og en ækvilibreringsperiode på 20 min. Forbindelser til bevægelsesundersøgelser blev opløst i embryomedier og blev testet i en koncentration på 250 liter med en endelig DMSO-koncentration på 2,5%.

kriterierne for en positiv hitbetegnelse var som følger: (i) et fald i gennemsnitshastigheden på 40% og (ii) en reduktion til fase 0 eller fase i anfaldsadfærd i bevægelsesplottet for mindst 50% af testfisken. Hver testforbindelse klassificeret som et’ positivt hit ‘ i bevægelsesanalysen blev vurderet for toksicitet ved direkte visualisering på et stereomikroskop efter en 90 min lægemiddeleksponering. Toksicitet (eller mortalitet) blev defineret som ingen synlig hjerterytme eller bevægelse som reaktion på ekstern stimulering hos mindst 50% af testfisken. Hyperekspertabilitet blev defineret som en forbindelse, der forårsagede en stigning på 40% i svømmehastighed og/eller fase III-anfaldsaktivitet hos mindst 50% af testfisken. Positive hits identificeret i den primære bevægelsesskærm blev bekræftet ved hjælp af bevægelsesscreeningsmetoden i et andet assay med en uafhængig kobling af sebrafisk. Forbindelser blev derefter købt separat fra Sigma-Aldrich og testet ved hjælp af bevægelsesscreeningsmetoden for tredje gang på en uafhængig kobling af sebrafisk. Lægemidler, der reducerede den gennemsnitlige svømmehastighed over tærsklen og var ikke-toksiske i de tre uafhængige bevægelsesassays, blev yderligere analyseret ved hjælp af det elektrofysiologiske assay. I elektrofysiologiske undersøgelser blev lægemidler først bekræftet i en koncentration på 250 liter ved hjælp af bevægelsesanalysen, og derefter blev den samme sebrafisk evalueret ved hjælp af en lokal feltpotentialoptagelse. Al screening blev udført med kodede forbindelser og analyseret af efterforskere blindet for forbindelsens identitet.

fylogenetisk analyse

fylogenetisk analyse af humane htr2-og sebrafisk htr2-proteinsekvenser blev udført med PhyML-programmet under SH-lignende sandsynlighedsforhold testparametre (http://www.phylogeny.fr/) (dereeper et al., 2008). Proteinsekvenser blev afledt af Ensembl human htr2a (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) og sebrafisk htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ENSDART00000104569), HTR2CL1 (ENSDART00000024191) sekvenser.

kvantitativ realtids mRNA-ekspressionsanalyse

ekspressionsniveauerne af sebrafisk htr2-gener blev undersøgt ved hjælp af RNA samlet fra 25 hoveder eller haler fra 5 DPF vildtype eller scn1Lab homosygøse mutantlarver og dissekerede hjerner fra individuel vildtype voksen han-sebrafisk. Det samlede RNA blev ekstraheret ved hjælp af et reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol og behandlet med DNase i (Invitrogen). Oprenset mRNA blev retrotransskriberet til cDNA ved hjælp af SuperScript Kurt III First-streng Synthesis System(Invitrogen) med en blanding af oligo (dT)20. Ekspressionsniveauerne af sebrafisk htr2-gener og husholdnings-genet eukaryot oversættelsesforlængelsesfaktor 1 alfa 1, som 1 (eef1a1l1) blev bestemt ved anvendelse af en stepon-LARP realtids-PCR-maskine (Applied Biosystems). Reaktionerne blev udført i 20 liter-volumener på 96-brøndsplader ved anvendelse af SYBR liter Green Master-blanding (Applied Biosystems) med 250 nM primer og 3 liter cDNA. Oligonukleotidsekvenser er anført i supplerende tabel 2. Data blev analyseret fra tre uafhængige eksperimenter. Data blev udtrykt som Ct-værdier og brugt til at bestemme Prisct-værdier.

humane studier

efter vellykket identifikation af forbindelser i vores sebrafiskmodel og overvejelse af farmakokinetik blev børn ordineret Belvik-kar (lorcaserin) under en medfølende brugsprotokol på Children ‘ s Hospital Colorado (IND 125307). Hvis de havde en SCN1A-mutation eller en klinisk diagnose af Dravet syndrom, og mislykkedes mindst to lægemidler, herunder stiripentol i nogle tilfælde og eksklusive natriumkanalblokkere. Børn skulle have et elektrokardiogram og ekkokardiogram ved baseline og hver 6.måned under brug af produktet. Derudover skulle de have opfølgende besøg hver 3.måned for at sikre tilstrækkelig vækst samt vurdere for yderligere bivirkninger. Laboratorietest var påkrævet hver 6.måned for at inkludere hæmatologisk test, leverfunktionstest og nyrefunktionstest. Dosis blev initieret ved 2,5 mg ved sengetid og steg gradvist ugentligt efter behov til en maksimal dosis på 10 mg to gange dagligt eller 0,3 mg/kg/dag—alt efter hvad der skete først.

godkendelse af institutionel gennemgang blev opnået til retrospektiv dataindsamling inklusive afkald på samtykke. Data blev uddraget fra en retrospektiv gennemgang af elektroniske lægejournaler på Børnehospitalet Colorado inklusive alder, anfaldstyper og hyppighed før og efter brug af belvik-Karr, bivirkninger, dosis Belvik-Karr og samtidig brug af medicin.

statistisk analyse

Data præsenteres som middelværdien af middelværdien (sem), medmindre andet er angivet. Til sammenligning mellem to grupper elevens t-test blev brugt. Når variansen ikke havde en normalfordeling den ikke-parametriske Mann-Hvidney U-test blev anvendt. Envejs ANOVA efter enten Dunnetts multiple sammenligningstest til analyse mod en kontrolprøve eller Holm-Sidak parvis flere sammenligninger mellem midler. Forskelle, der betragtes som statistisk signifikante, er angivet med stjerner (*P < 0,05; **P < 0,01).

resultater

effekt af clemisol på anfaldsadfærd hos sebrafisk

vi behandlede scn1Lab mutant larver (5 DPF) med clemisol i koncentrationer mellem 30 og 400 liter og overvågede derefter effekten på spontan anfaldsadfærd ved hjælp af automatiseret bevægelsessporingsprogram. Baseret på 250 gentagne lokomotivkontrolforsøg med ubehandlede scn1lab-mutanter blev en reduktion i den gennemsnitlige svømmehastighed på 40% (>1, 5 liter SD) fra baseline sat som tærskelværdi for positiv suppression af anfaldsadfærd. (Fig. 1A) udviste antiepileptisk aktivitet ved 300 og 400 liter (30 min.eksponering) og ved 100 liter (90 min. eksponering) (Fig. 1B); langvarig eksponering var toksisk ved de højere koncentrationer. For at afgøre, om clemisol kan undertrykke spontan anfaldsadfærd i en anden sebrafisk scn1-mutant, screenede vi mutante scn1Laa-larver (5 DPF) i bevægelsessporingsanalysen. Larver identificeret som anfaldsadfærd i fase III (f.eks. kramper i hele kroppen, svømmeaktivitet med høj hastighed og et kort tab af kropsholdning; Fig. 1C) blev bekræftet som udviser elektrografiske udladninger med interictal – og ictal-lignende komponenter i efterfølgende feltoptagelser fra forhjernen (Fig. 1D). Gennemsnitlig svømmehastighed for larver identificeret som S3 eller’ formodede scn1Laa-mutanter ‘ sebrafisk var signifikant højere end for søskendekontrol eller alle testede larver (Fig. 1E); mutanter blev bekræftet som scn1Laa homosygoter ved post hoc PCR. Vi testede derefter lægemidler, der tidligere har vist sig at undertrykke spontane anfald i Dravet syndrom og scn1Lab mutanter (250 liter stiripentol og 250 liter diasepam) samt 250 liter lamotrigin (en AED, der kan forværre anfald i Dravet syndrom). Som forventet undertrykte stiripentol, men ikke lamotrigin, signifikant anfaldsadfærd hos scn1laa-mutantlarver; 250. 1F). Sammen viser disse undersøgelser, at clemisol kan undertrykke anfaldsadfærd i to forskellige scn1-mutante sebrafiskelinjer.

undersøgelse af virkningsmekanismen for clemisol

sekundær lægemiddelskærm ved hjælp af scn1Lab mutanter

tertiær screening for at identificere lovende blyforbindelser til klinikken

5-HT-receptorekspression i sebrafisklarver

da clemisol har signifikant bindingsaffinitet til HTR2A og htr2b, og både trasodon og lorcaserin er 5-HT signalmodulatorer, forsøgte vi at bekræfte ekspressionen af disse receptorer i sebrafisk. Proteinsekvensjustering af humane og sebrafisk HTR2-receptorer afslørede evolutionær konservering med sebrafiskortologer, hvor Htr2aa og Htr2ab begge udviser 59,3% proteinidentitet med den humane htr2a; og en enkelt htr2b-ortolog, Htr2b viser 62,0% proteinidentitet. Kvantificering af htr2-ekspressionsniveau ved hjælp af isolerede hoveder eller haler af 5 DPF vildtype-eller scn1Lab-mutantlarver afslørede beriget htr2a og htr2cl1-ekspression i hovedet. Lignende resultater blev opnået fra voksen vildtype sebrafisk hjerne, da mutante larver ikke overlever til voksenalderen (supplerende Fig. 4).

reduktion af anfaldsfrekvens hos patienter med Dravet syndrom

Dravet syndrom er en katastrofal barndomsepilepsi og sjælden lidelse (http://www.rarediseases.org/) med svækkende resultater inklusive ufravigelig epilepsi, stærkt begrænset kognitiv udvikling og risiko for SUDEP. Vores prækliniske data bekræfter, at modulering af 5-HT-signalering kan undertrykke anfald forbundet med SCN1A tab af funktionsmutationer. Fordi identificerede 5-HT-modulatorer er FDA-godkendte forbindelser med kendte sikkerhedsprofiler, kan behandling med disse genbrugte lægemidler ændre anfaldsfrekvensen hos børn med Dravet syndrom. Denne translationelle tilgang er rettet mod sjældne og ødelæggende sygdomme, for hvilke store kliniske forsøg ikke er mulige (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

da det ikke i øjeblikket er fremstillet eller tilgængeligt i formulering af klinisk kvalitet, kan det fungere som en 5-HT-receptoragonist eller antagonist afhængigt af koncentration (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), valgte vi at evaluere Belvik karrus (lorcaserin) under et medfølende off-label-program i en lille population af børn med Dravet syndrom. Disse børn viste sig at være resistente over for mindst fem godkendte AED ‘ er. Fem børn (gennemsnitsalder: 11,8 år; interval: 7-18 år) heterosygøs til sletning i SCN1A blev behandlet prospektivt med Belvik children ‘ s Hospital Colorado (Aurora, CO). Behandlingsprotokollen blev godkendt af Colorado Medical Institutional anmeldelse Board (COMIRB), og forældre til Dravet syndrome-patienter samtykkede skriftligt til deres barns deltagelse. Vi gennemgik retrospektivt det dagbogsrapporterede antal atoniske, myokloniske og generaliserede tonisk-kloniske (GTC) anfald, bivirkninger og samtidige AED ‘ er.

de kliniske karakteristika ved Dravets syndrombørn behandlet med belvik-karrus er opsummeret i tabel 1. Der var ingen dødsfald blandt de fem Belvik-behandlede patienter, og belvik-patienter blev veltolereret uden alvorlige bivirkninger, der forårsagede ophør af behandlingen. En patient var oprindeligt anfaldsfri i 3 uger, en patient var anfaldsfri i 2 uger, og en tredje patient havde 1-2 anfaldsfrie dage om ugen. Alle fem patienter udviste en reduktion i det samlede antal anfald. Generaliserede tonisk-kloniske anfald blev signifikant reduceret hos patienter 1, 2 og 3. Faktisk oplevede Patient 2 en 90% reduktion i generaliserede tonisk-kloniske anfald uden behov for redningsmedicin. To patienter forbliver i behandling med belvik med ingen stigning i anfaldsfrekvensen, og som forventet var den mest almindelige bivirkning en nedsat appetit. En patient genstartede medicinen en anden gang med midlertidig forbedring i en kort periode og derefter tilspidset.

Diskussion

Clemisol, en første generation antihistamin opdaget i 1950 ‘ erne., 1952), blev identificeret som et potentielt terapeutisk middel til behandling af Dravet syndrom ved hjælp af scn1Lab mutant sebrafisk til at screene genbrugte lægemiddelbiblioteker (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Her bekræftede vi en antiepileptisk aktivitet for clemisol ved hjælp af en anden scn1-mutantmodel. Desværre metaboliseres clemisol hurtigt i mus med en plasmahalveringstid på <10 min (sammenlignet med 3,4 timer hos mennesker) (Nishimura et al., 2013), der begrænser dens evaluering i murine modeller. Anvendes med succes som antihistamin (et al., 1952; Jacobsen et al., 1960) med akutte og kroniske undersøgelser, der rapporterede en lav grad af toksicitet (Finkelstein et al., 1960), fremstilles ikke længere og er i øjeblikket ikke tilgængelig til off-label klinisk administration. Mangler et middel til effektivt at evaluere clemisol i prækliniske gnavermodeller, brugte vi sebrafisk til målengagement (5-HT receptorer) og identifikation af relaterede lægemidler med passende sikkerhedsprofiler, der letter hurtig oversættelse til en klinisk anvendelse. Medfølende brug, off-label recept af Belvik karrus (lorcaserin) til medicinsk uhåndterlige Dravet syndrom patienter er også beskrevet.

antihistamin H1-receptorantagonister er normalt kontraindiceret hos pædiatriske patientpopulationer (Miyata et al., 2011) og screening af disse lægemidler bekræftede deres manglende evne til at undertrykke (og i nogle tilfælde forværre) anfald hos scn1-sebrafisk. Bindingsdata afslørede en tidligere ukendt clemisolaffinitet for htr2a-og / eller HTR2B-receptorer. En efterfølgende fænotypisk skærm af målrettede biblioteker identificerede to 5-HT-modulerende forbindelser, trasodon og lorcaserin, der er i stand til at undertrykke adfærdsmæssige og elektrofysiologiske anfald på en måde, der kan sammenlignes med clemisol. Lorcaserin er en FDA-godkendt htr2c agonist ordineret til kronisk vægtkontrol (Thomsen et al., 2008). Desyrel er også et FDA-godkendt antidepressivt middel, der almindeligvis ordineres til søvnforstyrrelser (Mendelson, 2005). Det klassificeres ofte som en htr2a-og htr2c-invers antagonist og 5-HT-optagelsesinhibitor (Stahl, 2009). Undersøgelser hos rotter tyder imidlertid på, at det kan virke som en htr2c-agonist ved højere koncentrationer (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). Det blev tidligere vist, at kronisk behandling var beskyttende mod elektrokonvulsive inducerede anfald hos mus (Chavan et al., 2010; Born et Al., 2012), der understøtter vores data fra scn1Lab mutant sebrafisk. En 5-HT-receptormedieret virkning for clemisol er også i overensstemmelse med en nylig fænotypisk skærm, hvor modulatorer af serotonerg signalering (inklusive clemisol) viste sig at være en effektiv behandling i en præklinisk model af Machado-Joseph sygdom. 2015); og undersøgelser her tyder på, at der er behov for yderligere udvikling til off-label test hos patienter med Dravet syndrom.

vores resultater tilføjer også til en voksende mængde beviser, der tyder på modulering af serotonerg signalering som en potent suppressor af anfaldsaktivitet, især i katastrofale barndomsepilepsier som Dravet syndrom. For nylig blev 7 af 10 patienter i lavdosisbehandling med 5-HT-genoptagelsesblokeren fenfluramin selvrapporteret at være anfaldsfri i 1 år (Ceulemans et al., 2016). En let fortykkelse af en eller to hjerteklapper blev rapporteret hos to af disse patienter i overensstemmelse med en mulig sammenhæng mellem brugen af fenfluramin og pulmonal hypertension (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Hos mennesker udtrykkes HTR2A og HTR2C i CNS, mens htr2b-ekspression er beriget i hjertet (Lambe et al., 2011; melts et al., 2013). Mere specifikt udtrykkes HTR2C på en underpopulation af hæmmende interneuroner (Liu et al., 2007) og aktivering af disse receptorer med 5-HT øger GABA-medieret synaptisk hæmning (Boothman et al., 2006) dvs.den antiepileptiske virkningsmekanisme, der ligger til grund for mange almindeligt ordinerede antiepileptika. Faktisk antyder de fleste prækliniske undersøgelser aktivering af HTR2A-og/eller HTR2C-receptorer har antiepileptiske virkninger (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), som er en rimelig virkningsmekanisme, der forbinder clemisol, lorcaserin, trasodon og 5-HT reuptake blocker fenfluramin (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Interessant nok var htr2b-ekspression i sebrafiskhjernen relativt lav, hvilket yderligere antydede, at disse lægemidler potentielt udøver antiepileptisk aktivitet via htr2a-eller HTR2C-receptoraktivering. Interessant nok har undersøgelser i Drosophila knock-in fluer, der bærer k1270t SCN1A human mutation i PARA-natriumkanalgenet, vist, at tilskud med en 5-HT-forløber (5-hydroksytryptophan) redder den varmeinducerede anfaldsfænotype (Schutte et al., 2014). Derudover vurderede en nylig undersøgelse ved anvendelse af scn1Lab-mutanter 13 5-HT-signalforbindelser og foreslog også en potentiel antiepileptisk rolle for modulatorer af 5-HT-signalering (Sourbron et al., 2016). Imidlertid anvendte disse sidstnævnte sebrafiskundersøgelser en fundamentalt anden protokol (24 timer versus 30-90 min lægemiddeleksponering), der ikke tidligere var valideret som vellykket identifikation af AED ‘ er anvendt i Dravet syndrom (valproat, stiripentol, bromider og ketogen diæt). 10 gange lavere end vi viser at være effektive i sebrafisk (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), og rapportering af en antiepileptisk virkning for hallucinogen TCB-2 (Fig. 5), foreslår, at direkte sammenligning af data fra laboratorier ved hjælp af forskellige procedurer skal fortolkes med forsigtighed.

samlet set konkluderer vi, at mutant sebrafisk er en passende model til hurtig screening og opdagelse af nye AED ‘ er, der med passende sikkerhedsprofiler direkte kan informere klinisk pleje af risikopatienter, såsom Dravet syndrom.

forkortelser

forkortelser
• 5-HT

  serotonin

• AED

  antiepileptisk lægemiddel

• dpf

  dage efter befrugtning

• GPCR

  g-proteinkoblet receptor

• isap

  integreret sebrafisk analyseplatform

anerkendelser

vi vil gerne takke medlemmer af Baraban laboratory, Brian Grone og Matthæus Dinday i særdeleshed, for nyttige drøftelser i løbet af disse undersøgelser.

finansiering

S. C. B anerkender finansiering fra NINDS R01 grant no. NS079214, UCSF Katalysatorpris og Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatsfond.

supplerende materiale

supplerende materiale er tilgængeligt på Brain online.