CK20 og CK5/6 immunhistokemisk farvning af Urotheliale neoplasmer: et perspektiv

abstrakt

Cytokeratiner tilhører familien af mellemliggende filamenter. De udtrykkes på en meget specifik måde i epitelceller, hvor de spiller en afgørende rolle i cellernes integritet og mekaniske stabilitet. Flere typer cytokeratiner er blevet beskrevet i normal såvel som neoplastisk urothelium. I tilfælde af urotheliale neoplasmer har ekspression af CK20 og CK5/6 vist sig i flere undersøgelser at have diagnostiske og prognostiske implikationer. Således manifesterer urotelkarcinom i lav kvalitet CK-ekspression begrænset til paraplycellerne, mens tumorer i høj kvalitet normalt har et udtryk i hele tykkelsen af urotel bortset fra basallaget. CK5 / 6-ekspression udtrykkes på den anden side i basalcellerne i alle lavkvalitets-og nogle højkvalitets urotheliale carcinomer. Diffus ck20-farvning ledsaget af tab af CK5/6-positivt basallag er normalt forbundet med aggressiv klinisk adfærd. Dobbelt farvning af diasene for disse cytokeratiner kan lette korrekt fortolkning og korrelation.

1. Introduktion

Cytokeratiner tilhører familien af 10 nm mellemliggende filament cytoskelet til stede i alle cellerne. Mellemliggende filamentproteiner udtrykkes på en meget celletypespecifik måde, og heri repræsenterer keratiner den typiske mellemliggende filamentkategori, der er til stede i epitelceller. Disse filamenter er en kompleks gruppe af vanduopløselige polypeptider, der varierer i størrelse fra 40.000 til 68.000 Mr. I epithelia kan keratinfilamenter bundtes som tonofilamenter, flette kernen, spænde gennem cytoplasmaet og fastgøres til de cytoplasmatiske plaketter i de typiske epitelcelle-celleforbindelser, desmosomerne. Således spiller keratiner en vigtig funktionel rolle i integriteten og den mekaniske stabilitet af både de enkelte epitelceller og epitelvævets og er en iboende del af kontinuumet af stabilitet fra enkeltcellen til vævsdannelsen .

keratinproteinerne kan opdeles i små sure type I og store basiske til neutrale type II keratiner. En unik egenskab ved keratinerne er, at de i modsætning til de andre mellemliggende filamentproteiner kun kan udgøre deres filamentøse trin ved pardannelse af type i og type II (1 : 1) molekyler. Blandt humane keratiner omfatter den nylige konsensusnomenklatur type i keratiner K9–K10, K12–K28og K31–K40 og type II keratiner K1–K8 og K71-K86. I det humane genom er keratingenerne grupperet på to forskellige kromosomale steder: kromosom 17k21.2 (type i keratiner undtagen K18) og kromosom 12k13.13 (type II keratiner og K18). Det antages, at de to cytokeratin-underfamilier opstod gennem genduplikation og efterfølgende divergens af CK8 og CK18 .

hver type epitelcelle udtrykker en karakteristisk kombination af to til ti cytokeratinisotyper. Således kan normale epitelceller in vivo eller in vitro identificeres med hensyn til deres cytokeratinisotypeprofil. De karakteristiske cytokeratinprofiler af de forskellige normale epitelcelletyper har tendens til at blive bevaret efter neoplastisk transformation, og denne funktion kan udnyttes ved tumordiagnose. Imidlertid kan cytokeratinprofiler af epitelceller også afspejle funktionel differentiering snarere end oprindelsesvæv. Således udtrykker metaplastiske celler cytokeratinprofilegenskaber ved deres morfologi snarere end deres normale modstykke .

2. Cytokeratinekspression i Urothelium under embryologisk udvikling

cytokeratinerne er den første mellemliggende filamenttype, der vises under embryogenese, og alle celler på et eller andet stadium af fosterudvikling er cytokeratin-positive. De første cytokeratinisotyper, der skal udtrykkes, er CK8 + CK18-parret. Under embryologisk epitel-mesenkymal transformation går cytokeratinekspression tabt af visse slægter af celler, som enten forbliver cytokeratin-negative og udvikler sig til bindevæv eller senere udtrykker cytokeratiner af sekundær epitel . Embryologisk udvikling af urinblæren er fra cloaca, en baggutstruktur, der er et almindeligt kammer til gastrointestinalt og urinaffald. I 4-7 ugers udvikling er cloaca opdelt af urorektal septum i to dele: posterior anorektal kanal og anterior urogenital sinus. Den øvre del af den urogenitale sinus danner urinblæren .

under den tidlige udvikling af blæren omdannes foringsepitelet gradvist fra simpelt endodermalt epitel til flerlags urotelforing. Som mønsteret af den endodermale foring i GI-kanalen er den udviklende urotelforing oprindeligt diffust positiv for CK20 i alle lag. Under efterfølgende modning af urothelet udvikles et basallag, som kan påvises ved CK5 og CK13 positivitet. Yderligere modning af urothelium indebærer tab af CK20 i stort set alle lag undtagen paraplycellerne. Således synes der at være tre forskellige faser af urothelial udvikling. Det første trin er kendetegnet ved mangel på basale celler og ck20-ekspression i alle lag. Den anden fase bestemmes af udseendet af basallaget, men ck20-ekspressionsmønsteret er stadig diffust. I det tredje og sidste trin er der modning af ck20-ekspressionsmønsteret, som kun er kendetegnet ved CK20 i paraplylaget. Det basale lag er veludviklet og kan demonstreres ved hjælp af CK5/6 eller ck13 immunfarvning .

3. Cytokeratinekspression i Normalt Urothelium

urinblæren er foret med urothelium, som er specialiseret til at fungere som en barriere for urin og til at rumme ændringer i det intraluminale volumen. Urothelium fremstår som et flerlags epitel med tre celleområder: (1) et basalcellelag sammensat af celler i kontakt med og orienteret vinkelret på kældermembranens plan; (2) mellemcelleområdet sammensat af 2-5 cellelag; (3) et luminal eller overfladisk cellelag sammensat af sene mellemliggende celler og store, ofte binukleerede, “paraply” celler med deres apikale overflade mod lumen. Paraplycellerne er kendetegnet ved en type celleforbindelser og ved tilstedeværelsen af specialiserede plaketter af den asymmetriske enhedsmembran i den apikale cellemembran og inden for intracellulære fusiforme vesikler . Dette udseende skyldes tilstedeværelsen af rigelig uroplakin i cellemembranen .

i det normale voksne urothelium udtrykkes CK7, CK8, CK18 og CK19 i alle urotheliale cellelag, CK5 udtrykkes basalt, og CK20 er forbundet med paraplyceller (Figur 1).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

(a) normalt urothelium, der afslører flere lag celler inklusive basalcelle, mellemceller og paraplyceller. (B) immunhistokemisk plet, der afslører normalt farvningsmønster for urothelet. Paraplycellerne er dekoreret af ck20 (magenta). De mellemliggende celler er ufarvede. Basalceller er dekoreret med CK5 / 6 farvning (brun).

der kan også være et par CK20-positive celler i det mellemliggende cellelag i nogle normale prøver .

4. Cytokeratinekspression i papillær Urothelial neoplasi

neoplastisk transformation af urotheliale celler giver anledning til urothelial carcinom, den mest almindelige form for blærekræft i de fleste lande. Mange patienter har overfladiske tumorer, som enten er ikke-invasive (pTa) eller kun invaderer lamina propria (pT1). Mens gentagelse er almindelig (50-70%), kan sygdommen normalt kontrolleres ved lokal behandling. Ikke desto mindre udvikler 10-15% af patienterne med overfladisk sygdom sig til sidst til muskelinvasiv og metastatisk sygdom. En stigning i lønklasse, kendetegnet ved et tab af differentiering, og tilstedeværelsen af dysplastiske ændringer er begge determinanter for dårlig prognose. Derudover viser nogle urotelcarcinomer basal/pladeformet differentiering, som har været forbundet med dårligere prognose .

det immunhistokemiske farvningsmønster for cytokeratin20 og CK5/6 varierer med typen og arten af den uroteliske neoplasma. For eksempel afslører papillære urotheliale neoplasmer med begrænset malignt potentiale (PUNLMP) såvel som lavkvalitets papillære carcinomer ck20 begrænset til paraplycellerne og CK5/6-farvning begrænset til basallaget, identisk med fordelingen af disse keratiner i det normale urothelium (figur 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

figur 2

(a) lavgradig papillær urothelial carcinom. (B) immunhistokemisk plet, der skildrer ck20 (magenta) ekspression begrænset til paraplycellerne og et velformet basallag afbildet ved CK5/6-farvning (brun). (C) urotelkarcinom i lav kvalitet med farvning af basalceller, men mangler paraplyceller.

højkvalitets urotheliale carcinomer har på den anden side tendens til at have diffus immunreaktivitet for CK20, der involverer paraplycellerne såvel som mellemlaget. Derudover kan basallaget demonstreres ved CK5 / 6-positivitet (figur 3).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

figur 3

(a) højkvalitets papillært urotelkarcinom. (b) papillært urotelkarcinom af høj kvalitet med diffus farvning i fuld tykkelse til CK20 og tilstedeværelse af basallag som demonstreret ved CK5/6-farvning. (C) urotelkarcinom af høj kvalitet, der afslører den diffuse tilstedeværelse af basalceller og farvning i fuld tykkelse for CK20.

papillært urothelialcarcinom af højere kvalitet afslører på den anden side ck20-ekspression i hele tykkelsen af urothelet med fravær af basallag og negativ farvning for CK5/6 (figur 4).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

figur 4

(a) urotelkarcinom i høj grad med delvis tab af basalceller, men diffus farvning for CK20. (B) urotelkarcinom i høj grad med næsten fuldstændigt tab af basale celler. (C) papillært urotelkarcinom af høj kvalitet, der afslører diffus immunhistokemisk farvning for CK20 og fuldstændig fravær af basallag uden farvning for CK5/6.

dette mønster med diffus ck20-farvning i fuld tykkelse i fravær af basallagfarvning er også et træk, der findes i urotheliale karcinomer af høj kvalitet med lamina propria eller muskelinvasion (figur 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 5

(a) urotelkarcinom i høj grad med tidlig invasion, der viser stærk ck20 cytoplasmatisk farvning og fravær af basale celler. (B) urotelkarcinom i høj grad med omfattende invasion. Carcinomcellerne er diffust positive for CK20, men basallaget er fraværende.

det er blevet foreslået, at mønsteret af ck20-farvning er et nyttigt supplement til morfologi ved diagnosen urothelial carcinom. Det er også blevet foreslået, at ck20-ekspression kan forudsige malignt potentiale i urotheliale tumorer i lav kvalitet, og derfor kan CK20 være nyttigt til at definere behandlingsstrategier for patienter med disse tumorer. Ck20-ekspression blev bibeholdt af de fleste af de rene urotheliale karcinomer, der bevarede det normale overfladiske lokaliseringsmønster i nogle veldifferentierede papillære tumorer eller viste en heterogen eller ensartet positiv reaktion gennem alle cellelag. Dele af karcinomet med pladedifferentiering afslører en reduktion af ck20-ekspression. Disse områder reagerer imidlertid positivt for CK5 / 6(figur 6(A) og 6 (b)) i et mønster, der adskiller sig fra basallagets basale fordeling .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

figur 6

(a) højkvalitets urothelialcarcinom med fokal pladedifferentiering. (B) immunhistokemisk farvning, der viser stærk CK5/6-farvning inden for pladedifferentiering. Den resterende del af carcinoma pletter til CK20. (C) urotelkarcinom af høj kvalitet med basoskavamiske morfologiske træk. (D) immunhistokemisk farvning i basoskavamt karcinom med stærk immunfarvning for CK5/6 og fuldstændig fravær af ck20-positivitet.

i nogle tilfælde kan hele karcinomet vise basoskvamiske træk. Disse tilfælde viser stærk reaktivitet for CK5 / 6 med ringe eller ingen positivitet for CK20 (figur 6(c) og 6(d)).

to nyligt offentliggjorte undersøgelser har givet yderligere bevis for den kliniske betydning af forskellige mønstre af immunfarvning for CK20 og CK5/6. I en af disse undersøgelser blev tumorprøver fra 222 patienter med urotelkarcinomer i øvre kanal, der blev behandlet med radikal nefroureterektomi, analyseret for ekspression af syv basale/luminale immunhistokemiske markører (CK5, EGFR, CD44, CK20, p63, GATA3 og ræva). Ved at bruge CK5 og CK20 definerede de fire undertyper af urotheliale karcinomer i øvre kanal:(I)udelukkende ck20−positiv og CK5−negativ (CK20+/CK5−) (ii)udelukkende CK5−positiv og CK20− negativ (CK20-/CK5+)(iii)begge markører positive (CK20+/CK5+)(iv)begge markører negative (CK20-/CK5 -)

i multivariat KKS regressionsanalyse var ck20+/CK5-undertypen en uafhængig negativ prognostisk markør med en 3,83 gange øget risiko for KRÆFTSPECIFIK død sammenlignet med de andre tre undertyper .

i en anden undersøgelse blev immunhistokemisk farvning for CK5/6 og CK20 rapporteret at være korreleret med prognosen for tidligt urotelkarcinom. Derudover blev genekspressionsprofilerne for undergrupper af ikke-muskelinvasiv papillær højkvalitets urotelkarcinom i øvre kanal (UTUC) klassificeret efter CK5/6 og CK20 ekspressionsniveauer undersøgt og korreleret med kliniske resultater. Disse undergrupper omfattede CK5 / 6-høj/CK20-lav, CK5/6-høj/CK20-høj og CK5/6-Lav/CK20-høj. Sidstnævnte gruppe karakteriseret ved lav ekspression af CK5/6 og høj ekspression af CK20 var forudsigelig for dårligere prognose for ikke-muskelinvasive papillære urotelkarcinomer af høj kvalitet. Transkriptionsanalyse afslørede 308 differentielt udtrykte gener på tværs af undergrupperne. Funktionelle analyser af generne identificerede celleadhæsion som en fælles proces differentielt beriget i denne undergruppe sammenlignet med de andre, hvilket kunne forklare dens højrisikofænotype. Sencellecyklus / proliferationssignaturer blev også beriget i denne undergruppe . Det ser således ud til, at urotheliale tumorer karakteriseret ved diffus farvning for CK20 i fravær af påviseligt basallag repræsenterer den mest aggressive undertype af papillært urothelialcarcinom.

Cytokeratin 5/6 er til stede i den normale keratiniserende epidermis og pladeformet slimhindeepitel såvel som i basale celler eller myoepiteliale celler i brystet, spytkirtler og prostata . I prostata-og brystbiopsier dekorerer CK5/6 basalcellelaget og er således nyttigt til diagnosticering af invasivt karcinom, hvor sidstnævnte er blottet for basalceller. Urotheliums arkitektur er forskellig fra det prostatiske eller brystkanale epitel med det resultat, at tilstedeværelsen eller fraværet af basale celler ikke kan bruges til at stratificere urotheliale neoplasmer til godartede eller ondartede typer. Fraværet af basale celler i urotheliale neoplasmer kan imidlertid indikere dårlig prognose. Således kan et urotelkarcinom af høj kvalitet med et konserveret basallag opføre sig mindre aggressivt sammenlignet med en anden højkvalitets tumor, hvor basallaget er gået tabt. I vores laboratorium bruger vi dobbeltfarvning til disse cytokeratiner, hvilket er yderst nyttigt i den korrekte fortolkning af disse pletter.

et lignende farvningsmønster kan også ses ved urotelkarcinom in situ . Disse læsioner er normalt stærkt reaktive for CK20 og kan eller ikke bevare det CK5/6-positive basalcellelag. Clinging type urothelial carcinoma in situ og pagetoid forlængelse af carcinomceller kan også genkendes ved positiv ck20-farvning (Figur 7).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 7

(a) Urotelkarcinom in situ med stærk immunfarvning i fuld tykkelse for CK20 med et tydeligt basalcellelag positivt for CK5/6. (b) et andet urotelkarcinom in situ med stærk farvning for CK20 og fravær af basallag. (C) Pagetoid forlængelse af urothelial carcinom demonstreret ved stærk cytoplasmatisk farvning for CK20 i en baggrund af flere lag basalceller reaktive for CK5/6.

i et mindretal af tilfælde kan carcinom in situ være reaktivt for CK5 / 6, hvilket indikerer en basaloid differentiering .

5. Embryologisk Urothelial differentiering versus Dedifferentiering i Urothelial neoplasi

den tætte sammenhæng mellem cytokeratinisotype ekspressionsmønstre og epitelial differentiering antyder, at cytokeratiner er afgørende for epitelvævsstruktur og/eller funktion. Det har imidlertid været vanskeligt at fastslå, hvad de nøjagtige bidrag fra individer eller kombinationer af cytokeratinisotyper er til normal og neoplastisk epitelcellefænotype og adfærd. Således afspejler ændringerne i ck20-immunolokalisering, som indikerer en højere risiko for urothelial carcinoma-gentagelse, sandsynligvis en sekundær ændring relateret til dysregulering af urothelial differentieringsprogrammet under carcinogenese snarere end at indikere, at CK20 er direkte involveret. Det kan spekuleres i, at ekspressionsmønstrene for CK20 og CK5/6 i forskellige urotheliale carcinomer har tendens til at efterligne stadierne af embryologisk udvikling og differentiering af urothelium. Således kan urotheliale carcinomer af høj kvalitet (med eller uden invasion), der er kendetegnet ved diffus ck20-ekspression uden noget basallag, repræsentere det tidlige stadium af urothelial differentiering, efter at den urogenitale sinus adskiller sig fra cloaca . I løbet af dette udviklingsstadium manifesterer urothelium diffus ck20-farvning, men mangler et basalt lag. I nogle af de højkvalitets urotheliale carcinomer er der ensartet farvning af alle lagene med CK20, men der er også et velformet basallag, der kan påvises ved ekspression af CK5/6. Dette kan svare til mellemstadiet af embryonal urothelial differentiering. De veldifferentierede urotheliale carcinomer er kendetegnet ved tilstedeværelsen af et modent mønster af ck20-ekspression, hvor dets ekspression for det meste er begrænset til paraplycellerne, mens veldefineret basalcellelag immunreaktivt for CK5/6 også er til stede (figur 8 og 9).

figur 8

(a) tegneserie, der viser stadier af differentiering under den embryologiske udvikling af urotheliet. I de tidlige stadier bevarer det udviklende urothelium ck20-ekspression, der normalt ses i cloaca. I løbet af dette trin er der ikke noget basalt lag til stede. (b) under udviklingen af urothelium kan basallaget ikke påvises ved farvning for CK5/6. (C) sidste fase af urothelial differentiering med normal ekspression af CK20 begrænset til paraplycellerne og tilstedeværelse af normalt basallag, der manifesterer ekspression af CK5/6.

figur 9

(a) tegneserie, der viser immunhistokemisk farvningsmønster i et lavkvalitets papillært urotelkarcinom med ck20-ekspression begrænset til paraplycellerne og tilstedeværelse af et veldefineret basallag, der udtrykker CK5/6. (B) urotelkarcinom af høj kvalitet afslører ekspression af CK20 i alle lag af urothelium undtagen det basale lag, der indeholder CK5/6. Dette kan repræsentere et mellemstadium af dedifferentiering af tumoren. (c) ved urothelial karcinom af høj kvalitet kan basallaget være fraværende, men det diffuse ck20-farvningsmønster opretholdes. Disse funktioner kan indikere yderligere dedifferentiering af karcinomet.

dette mønster kan svare til den sidste fase af urothelial udvikling og modning i intrauterin perioden.

sammenfattende kan immunhistokemisk farvning af urothelial carcinom for CK20 og CK5/6 give nyttige oplysninger om arten af urothelial carcinom og dets kliniske adfærd.

datatilgængelighed

Ingen data blev brugt til at understøtte denne undersøgelse.

interessekonflikter

forfatterne erklærer, at de ikke har nogen finansiering eller interessekonflikter at afsløre.

anerkendelser

forfatterne vil gerne anerkende værdifuld hjælp og teknisk ekspertise fra følgende tilsyns-og tekniske medarbejdere i vores immunhistokemiske laboratorium til udførelse af den tofarvede immunhistokemiske farvning: ms Rajaa Al Abdulla, vejleder; Fru Huda Ahmed Al Hijji, vejleder; og fru Suhoor Ali, seniorteknolog.