Cisplatin ototoksicitet involverer cytokiner og STAT6 signalnetværk

reagenser

Cisplatin og 3-(4, 5-dimethylthiasol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrasoliumbromid (MTT) blev købt fra Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, USA). Plastkulturmaterialerne blev købt fra Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA). Dulbeccos modificerede essentielle medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) og andre vævskulturreagenser blev opnået fra Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Rekombinant Muse-IL-4-og IL-13-protein, antistoffer mod IL-4, IL-13, TNF-Karri, IL-1 Karri, IL-6 Og Elisa-kits (mængder) til cytokiner blev købt fra R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Disse antistoffer blev anvendt til immunhistokemi i en koncentration på 1:200. Antistoffer mod P-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) og IkB blev købt hos biotek Inc. (San Francisco, CA, USA).

cellekultur og levedygtighed

etablering og karakterisering af de betinget udødelige Hei-OC1 auditive celler blev beskrevet i vores tidligere rapport 1. Ekspression af OHC-specifikke markører såsom Math1 og Myosin 7a antyder, at HEI-OC1-celler repræsenterer OHC-forløbere. HEI-OC1-celler blev opretholdt i HØJGLUCOSEDMEM (Gibco BRL) indeholdende 10% FBS. Til de nedenfor beskrevne eksperimenter blev HEI-OC1-celler dyrket under følgende tilladelige betingelser: 33 liter C og 5% CO2 i DMEM suppleret med 10% FBS. Celler (3 liter 104 celler/brønd af en 24-brøndsplade) blev inkuberet med 20 liter cisplatin i 24 timer. for at bestemme cellens levedygtighed blev MTT (0,25 mg) tilsat til en 1 ml cellesuspension i 4 timer. efter vask af cellerne og tre vasker med PBS (pH 7,4) blev det uopløselige formasanprodukt opløst i DMSO. Den optiske densitet (OD) for hver kulturbrønd blev derefter målt ved hjælp af en Mikropladelæser (Titertek Multiskan, Strømningslaboratorier) ved 590 nm. KONTROLCELLERNES OD blev taget for at indikere 100% levedygtighed. For at undersøge virkningerne af forskellige cytokiner blev neutraliserende antistoffer mod cytokiner tilsat til kulturerne i 30 minutter, hvorefter de blev dyrket med 20 liter cisplatin i 24 timer.

Dyr

STAT4−/− (backcross generation N10), STAT6−/− (backcross generation N6) og vægt BALB/C mus blev købt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). De homosygøse STAT4-og STAT6-ko-mus blev identificeret ved PCR. KO-musene viste ingen udviklingsmæssige abnormiteter. Eksperimenter blev udført i 6 uger gamle mus, og alle mus blev aldersmatchet inden for 3 dage. Mus blev fodret med en standard kommerciel diæt, mens de blev anbragt ved en omgivelsestemperatur på 20-22 liter C og en relativ fugtighed på 50 liter 5% under en 12:12 timer lys:mørk cyklus i et specifikt patogenfrit anlæg. Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care and Use Committee.

Luciferase reporter assay

celler blev transient transficeret med NF-kB luciferase reporter plasmid ved hjælp af transfektionsreagens, Lipofectamine 2000. Efter 36 timers inkubation blev cellerne behandlet med cisplatin i 12 timer i nærvær af neutraliserende cytokinantistoffer. Cellerne blev derefter vasket to gange med PBS buffer og efterfølgende lyseret i reporter lysis buffer (Promega, Madison, Vi, USA). En 20-liters alikvot af lysatet blev derefter blandet med 100-liter luciferaseassayreagens, hvorefter den udsendte lysintensitet blev målt ved hjælp af et luminometer AutoLumat LB953 (f.eks. og G Berthold, dårlig Vildbad, Tyskland). Endelig blev luciferaseaktiviteten målt i tre eksemplarer, i gennemsnit og derefter normaliseret i forhold til den oprensede aktivitet ved hjælp af galactosidaseanalysesystemet (Galacto-Light, Tropic Inc., MA, USA) i henhold til producentens instruktion.

transfektion med siRNA-konstruktioner

foruddesignede sirna ‘ er mod mus STAT4, STAT6 og kontrol scrambled siRNA blev købt fra Santa Crus bioteknologi. Sense-strengene af siRNA ‘ er mod STAT4 og STAT6 er som følger. STAT4 Sirnas-konstruktionen er en pulje af tre sekvenser af siRNA som følger: dupleks 1 Sense Strand: 5′-Indekstermgua GCU GUG GUA AUU UCA a-3′, dupleks 2 Sense Strand: 5′-Indeksermcua CCU UCC UCC UCCU ACA a-3′ og dupleks 3 Sense Strand: 5′-Indeksermcug UCG UGA UGA UUU CUA a-3′ (mRNA tiltrædelsesnummer: NM_011487). STAT6 siRNAs-konstruktionen er en pulje af tre sekvenser af siRNA som følger: dupleks 1 Sense streng: 5′-Indekstermgau GCU UUC UGU UAC AAC a-3′, dupleks 2 Sense streng: 5′-Indeksermcua GCC UUC UCC UCA AUG a-3′ og dupleks 3 Sense streng: 5′-Indeksermguc UCU ACU ACU AUC Aag a-3’ (mRNA tiltrædelsesnummer: NM_009284). Celler blev transient transficeret med 100 nM siRNA-konstruktioner i Sirna-transfektionsreagens (Roche Applied Science, Pensberg, Tyskland) i henhold til producentens protokol. Efter inkubation ved 33 liter C og 5% CO2 i 36 timer blev cellerne yderligere behandlet med cisplatin i 24 timer. prøverne blev derefter fremstillet og analyseret for levedygtighed eller vestlig blot-analyse. Interferensen af ekspression blev bekræftet ved immunoblotanalyse.

måling af proinflammatoriske cytokiner ved ELISA

for at måle sekretionen af proinflammatoriske cytokiner fra de cisplatinbehandlede celler blev Kultur-supernatanter høstet på hvert tidspunkt, og niveauerne af udskillede proinflammatoriske cytokiner blev derefter bestemt af ELISA (Kvanticintokinsæt; R & D Systems Inc.) i henhold til producentens anvisninger.

fremstilling af cytosoliske og nukleare ekstrakter

celler blev vasket med iskold PBS, skrabet og centrifugeret ved 1 000 liter g i 5 minutter ved 4 liter C. cellepelleten blev derefter resuspenderet i 200 liter lysisbuffer (10 mm HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid, og 0,5 mm dithiothreitol) og derefter inkuberet på is i 15 minutter. Ved slutningen af inkubationen blev der tilsat 10 liter på 10% NP-40, og røret blev virvlet i 10 sekunder. Efter centrifugering ved 13 000 liter g i 1 min ved 4 liter C blev supernatanten (cytosolisk ekstrakt) opsamlet og opbevaret ved -80 liter C, hvorimod pelleten blev yderligere behandlet for at opnå de nukleare ekstrakter. Pelleten blev derefter resuspenderet i ekstraktionsbuffer (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM dithiothreitol og 25% (vol/vol) glycerol) og inkuberet i 30 minutter ved 4 liter C. nukleare ekstrakter blev isoleret ved centrifugering ved 13 000 liter g i 30 minutter ved 4 liter C. Supernatanten blev derefter fjernet og opbevaret ved -80 liter C, indtil den blev brugt til vestlig blot-analyse. Endelig blev proteinkoncentrationen bestemt ved den lave metode.

vestlig blot-analyse

vestlig blot-analyse blev udført som følger. Kort sagt blev cellerne høstet og vasket to gange med iskold PBS. De totale og nukleare / cytosoliske fraktionerede lysater blev derefter underkastet elektroforese på 12% SDS-polyacrylamidgeler i 3 timer ved 20 mA, hvorefter de blev overført til nitrocellulose. Membranen blev derefter inkuberet i 5% (vægt/vol) tørret mælkeprotein i PBS indeholdende 0,05% (vol/vol) mellem-20 (PBS-T) i 1 time, hvorefter de blev vasket i PBS-T og derefter yderligere reageret med primært antistof (1:1 000) i 1 time. dernæst blev membranen grundigt vasket med PBS-T og derefter inkuberet med anti-kanin IgG-antistof konjugeret til HRP (1:3 000) i 1 time. efter omfattende vask blev proteinbånd på membranen vasket med blev visualiseret ved hjælp af kemiluminescerende reagenser i henhold til producentens anvisninger (supersignal substrat; Pierce, Rockford, IL, USA).

In vivo eksperiment med cisplatin ototoksicitet

alle mus blev tilfældigt opdelt i to grupper på seks mus hver. Gruppe 1-dyr, der blev betragtet som en kontrolgruppe, modtog intraperitoneal injektion af PBS. Gruppe 2-dyr blev administreret cisplatin (4 mg/kg legemsvægt) ved intraperitoneal injektion i 4 på hinanden følgende dage. Dyrene blev derefter dræbt under anæstesi ved hjælp af CO2-gas dagen efter den endelige cisplatininjektion, hvorefter temporal knogle i højre øre blev fjernet.

måling af ABR

til yderligere analyse af den auditive tærskel blev ABR målt før og 24 timer efter den endelige behandling af cisplatin. ABR-tærskelændringerne mellem præ-behandling og efterbehandling blev derefter sammenlignet. Mus blev bedøvet ved hjælp af en cocktail af ketamin (40 mg/kg) og 10 mg/kg og holdt varm med en varmepude under ABR-optagelse. En subdermal (aktiv) nålelektrode blev indsat i toppunktet, mens jord-og referenceelektroder blev indsat subdermalt i den løse hud under toppen af modsatte ører. Test stimuli bestod af vekslende fase tone bursts ved frekvenser på 4, 8, 16 og 32 KHS. Signaler blev genereret ved hjælp af Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) Siggen. Hver tone burst (1 ms varighed) blev gated gennem et Blackmann vindue og havde en 0,5 ms stigning-fald tid uden plateau. Stimuli blev kalibreret før hver testsession ved at optage højttalerens output med en mikrofon placeret på dyrenes hovedniveau. ABR-bølgeformer blev i gennemsnit som reaktion på 300 toneudbrud ved hver testet frekvens. Ved hver frekvens dæmpes signalets amplitude automatisk i 10 dB-trin fra 90 dB SPL, indtil ABR-bølgerne forsvandt i spor registreret med filterindstillinger på 100-3 000 HS. Dommen over tærsklen blev foretaget offline af to uafhængige, eksperimentelt blinde observatører baseret på ABR-optegnelserne.

overfladebehandling af Corti-eksplanternes organ

alle mus blev dræbt dagen efter den endelige cisplatininjektion. Den temporale knogle blev dissekeret ud og fikseret i 4% paraformaldehyd i 16 timer ved 4 kg C og skyllet med 0,1 M PBS. Den tidsmæssige knogle blev yderligere afkalket med 10% EDTA i PBS i 3 dage. Cochlea blev omhyggeligt dissekeret ud. Derefter blev stria vascularis og spiralbåndet dissekeret væk, hvilket efterlod Corti-organet. Den midterste drejning af cochlea blev nedsænket i TRITC-mærket phalloidin (Sigma P1951, 1:100) i PBS i 20 minutter. Efter tre vaske med PBS blev prøven undersøgt under et fluorescensmikroskop ved hjælp af passende filtre til TRITC (spænding: 510-550 nm, emission: 590 nm).

immunhistokemisk farvning og TUNELASSAY

den fjernede temporale knogle blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 16 timer og derefter afkalket med 10% EDTA i PBS i 2 uger, hvorefter den blev dehydreret og indlejret i paraffinvoks. Sektioner på 5 liter blev deparaffineret i kylen og rehydreret gennem graderede koncentrationer af ethanol. Til immunhistokemiundersøgelsen blev der anvendt et immunhistokemikit (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, USA), og procedurer blev udført i henhold til producentens anvisninger. Den endogene peroksidase blev derefter blokeret med 3% brintoverilte i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Efter at sektionerne blev vasket i PBS, blev ikke-specifik binding blokeret med 1% bovint serumalbumin i 1 time. primære antistoffer (1:200 fortyndet) blev derefter tilsat til objektglassene, hvorefter inkubationen fortsatte i 1 time. efter gentagen vask med PBS blev sektionerne inkuberet med biotinyleret sekundært antistof i 30 minutter og derefter dækket i 30 minutter med et sekundært antistof indeholdende peberrodsperoksidase. Endelig blev sektionerne farvet i en frisklavet substratopløsning (3 mg 3-amino-9-ethylcarbasol i 10 ml natriumacetatbuffer (pH 4,9), 500 liter dimethylformamid, 0,03% brintoverilte) i 5 min. Kernerne i de immunfarvede celler blev derefter modfarvet med Mayers hæmatoksylin (Sigma-Aldrich Co.). Apoptotiske celler blev påvist in situ ved anvendelse af TUNEL-analysen (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Tyskland). Kort sagt blev en sektion deparaffineret og rehydreret. Efter inkubation med 20 liter/ml proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Tyskland) blev den endogene peroksidase blokeret ved at inkubere prøverne i 2% H2O2 i methanol i 30 minutter ved RT. derefter blev vævssektionerne vasket i PBS og inkuberet med mærkningsopløsning i 1 time ved 37 liter C. kernerne blev derefter modfarvet med propidiumiodid (0,5 liter/ml, molekylære prober) i 10 minutter ved RT. efter vask med PBS blev prøven undersøgt under en fluorescensmikroskop.

revers transkriptase-PCR-amplifikation

til cochlear PCR blev den venstre øre temporale knogle hurtigt høstet og nedsænket i Rnalater (Ambion, Inc. C. Derefter blev hele cochleae dissekeret ud og brugt til at ekstrahere total RNA ved brug af Trisol (Invitrogen) i henhold til producentens protokoller. Efter ekstraktion af det totale RNA under anvendelse af Trisol (Invitrogen) blev enkeltstrenget cDNA syntetiseret fra det totale RNA. Derefter blev PCR udført med Takara-DNA-polymerase (Takara, Takara Shuso, Japan) ved at udsætte prøverne for 30 cyklusser på 95 liter C i 40 sekunder, 58 liter C i 40 sekunder og 72 liter C i 50 sekunder. ti mikroliter af PCR-produkterne blev derefter adskilt på 1,2% agarosegel og visualiseret under UV-lys. Sekvenserne af primerne anvendt til PCR-amplifikation var som følger: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, omvendt, 5 ‘- Indeksmgca GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

statistisk analyse

hvert eksperiment blev udført mindst tre gange, og alle rapporterede værdier repræsenterer midlerne til triplikatanalyser. Statistisk multivariat analyse blev udført ved analyse af varians-og Duncan-test ved hjælp af SPSS 11 (Chicago, IL, USA) statistisk program. Tovejs ANOVA og / eller envejs ANOVA blev brugt til at bestemme betydningen af resultaterne. De statistiske resultater blev gennemgået af en biostatistiker på masterniveau. Værdier af P < 0.05 blev anset for at være statistisk signifikante.