Cirkulerende tumor-DNA

præanalytiske overvejelserredit

når blod opsamles i EDTA-rør og opbevares, begynder de hvide blodlegemer at lyse og frigive genomisk vildtype-DNA i prøven i mængder, der typisk er mange gange højere end ctDNA er til stede i. Dette gør påvisning af mutationer eller andre ctDNA-biomarkører vanskeligere. Anvendelse af kommercielt tilgængelige cellestabiliseringsrør kan forhindre eller forsinke lysis af hvide celler og derved reducere ctDNA ‘ ens fortyndingseffekt. Demonstreret overlegen påvisning af KRAS mutationer i matchede prøver indsamlet i både EDTA K3 og Streck BCT rør. Fordelene ved cellestabiliseringsrør kan realiseres i en situation, hvor blod ikke umiddelbart kan behandles til plasma.

andre procedurer kan også reducere mængden af” forurenende ” vildtype-DNA og gøre detektion af ctDNA mere gennemførlig:

• frys aldrig en blodprøve, før plasmaet ekstraheres til ctDNA-analyse
• behandl prøven til plasma inden for 2-4 timer (hvis det opsamles i EDTA-rør)
• Brug aldrig hepariniserede rør, heparin hæmmer PCR ved at efterligne den spiralformede struktur af DNA
• udfør et dobbelt centrifugeringstrin (centrifuge blodet for at fjerne plasma, gentag derefter på plasma for at fjerne fra snavs i bunden af røret) for at fjerne mere cellulært affald inden DNA-ekstraktion.
• Plasma er bedre end serum til ctDNA-genopretning

ekstraktion af ctDNAEdit

hovedappellen ved ctDNA-analyse er, at den ekstraheres på en ikke-invasiv måde gennem blodopsamling. Erhvervelse af cfDNA eller ctDNA kræver typisk opsamling af cirka 3 ml blod i EDTA-belagte rør. Brugen af EDTA er vigtig for at reducere koagulering af blod. Plasma – og serumfraktionerne af blod kan adskilles gennem et centrifugeringstrin. ctDNA eller cfDNA kan efterfølgende ekstraheres fra disse fraktioner. Selvom serum har tendens til at have større niveauer af cfDNA, tilskrives dette primært DNA fra lymfocytter. Høje niveauer af kontaminerende cfDNA er suboptimale, fordi dette kan mindske følsomheden af ctDNA-detektion. Derfor bruger størstedelen af undersøgelserne plasma til ctDNA-isolering. Plasma behandles derefter igen ved centrifugering for at fjerne resterende intakte blodlegemer. Supernatanten bruges til DNA-ekstraktion, som kan udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.

analyse af ctDNAEdit

analysen af ctDNA efter ekstraktion kræver anvendelse af forskellige amplificerings-og sekventeringsmetoder. Disse metoder kan opdeles i to hovedgrupper baseret på, om målet er at forhøre alle gener i en ikke-målrettet tilgang, eller om målet er at overvåge specifikke gener og mutationer i en målrettet tilgang.

ikke-målrettede tilgangeredit

et helt genom eller hele eksomsekvenseringsmetoder kan være nødvendigt for at opdage nye mutationer i tumor-DNA under overvågning af sygdomsbyrde eller sporing af lægemiddelresistens. Ikke-målrettede tilgange er også nyttige i forskning for at observere tumor heterogenitet eller for at opdage nye lægemiddelmål. Selvom ikke-målrettede metoder kan være nødvendige i visse applikationer, er det dyrere og har lavere opløsning. Dette gør det vanskeligt at opdage sjældne mutationer eller i situationer, hvor lave ctDNA-niveauer er til stede (såsom minimal restsygdom). Desuden kan der være problemer med at skelne mellem DNA fra tumorceller og DNA fra normale celler ved hjælp af en hel genomtilgang.

Helgenom eller eksomsekventering bruger typisk DNA-sekventeringsteknologier med høj kapacitet. Begrænsning af sekventeringen til kun hele eksomet kan i stedet reducere omkostningerne og øge hastigheden, men på bekostning af at miste information om mutationer i de ikke-kodende regulatoriske regioner af DNA. Mens man blot ser på DNA-polymorfier gennem sekventering ikke differentierer DNA fra tumor eller normale celler, kan dette problem løses ved at sammenligne med en kontrolprøve af normalt DNA (for eksempel DNA opnået gennem en buccal vatpind.) Det er vigtigt, at hele genomet og hele eksomsekventering er nyttige til indledende mutationsopdagelse. Dette giver information til brug af mere følsomme målrettede teknikker, som derefter kan bruges til sygdomsovervågningsformål.

Helgenomsekventering gør det muligt at genvinde de strukturelle egenskaber af cfDNA, størrelsen af fragmenter og deres fragmenteringsmønstre. Disse unikke mønstre kan være en vigtig informationskilde for at forbedre påvisningen af ctDNA eller lokalisere oprindelsesvævet for disse fragmenter. Størrelsesvalg af korte fragmenter (<150bp) med in vitro eller in silico metoder kunne forbedre genopretningen af mutationer og kopiantalafvigelser.

Digital Karyotypedit

denne metode blev oprindeligt udviklet af laboratoriet Bert Vogelstein, Luis Diasog Victor Velcescu ved Johns Hopkins University. I modsætning til normal karyotyping, hvor et farvestof bruges til at plette kromosomale bånd for at visualisere kromosomerne, digital karyotyping bruger DNA-sekvenser af loci i hele genomet for at beregne variation i kopiantal. Kopi nummervariationer er almindelige i kræftformer og beskriver situationer, hvor tab af heterosygositet af et gen kan føre til nedsat funktion på grund af lavere ekspression eller duplikering af et gen, hvilket fører til overekspression.

Personlig analyse af omarrangerede ender (PARE)Rediger

efter at hele genomet er sekventeret ved hjælp af en sekventeringsmetode med høj kapacitet, f.eks. Denne teknik blev oprindeligt designet til at analysere fast tumor-DNA, men blev modificeret til ctDNA-applikationer.

DNA-methylering og Hydroksimethyleringredit

korrekt epigenetisk mærkning er afgørende for normal genekspression og cellefunktion, og afvigende ændringer i epigenetiske mønstre er et kendetegn for kræft. En normal epigenetisk status opretholdes i en celle i det mindste delvist gennem DNA-methylering. Måling af afvigende methyleringsmønstre i ctDNA er mulig på grund af stabil methylering af DNA-regioner kaldet “CpG-øer”. Methylering af ctDNA kan påvises gennem bisulfitbehandling. Bisulfitbehandling omdanner kemisk umethylerede cytosiner til en uracil, mens methylerede cytosiner efterlades uændret. DNA sekventeres efterfølgende, og eventuelle ændringer i DNA-methyleringsmønsteret kan identificeres. DNA-hydroksymetylering er et lignende associeret mærke, der har vist sig at være en forudsigelig markør for sunde versus syge tilstande i cfDNA, inklusive kræft. Måling af afvigende hydroksymetyleringsmønstre i ctDNA er blevet bevist af forskere ved University of Chicago (Chuan he lab,) Stanford University (Jordskælvslaboratorium) og firmaet Cambridge Epigenetik.

målrettede approachesEdit

i en målrettet tilgang kan sekventering af ctDNA rettes mod et genetisk panel konstrueret baseret på mutationelle hotspots for kræft af interesse. Dette er især vigtigt for at informere behandling i situationer, hvor mutationer identificeres i druggable mål. Tilpasning af målrettet analyse af ctDNA til hver patient er også mulig ved at kombinere flydende biopsier med standard primære vævsbiopsier. Hele genomet eller hele eksomsekventering af den primære tumorbiopsi muliggør opdagelse af genetiske mutationer, der er specifikke for en patients tumor, og kan bruges til efterfølgende målrettet sekventering af patientens ctDNA. Den højeste følsomhed ved ctDNA-detektion opnås gennem målrettet sekventering af specifikke enkelt nukleotidpolymorfier (SNP ‘ er). Almindeligt muterede gener, såsom onkogener, som typisk har hotspotmutationer, er gode kandidater til målrettede sekventeringsmetoder. Omvendt har de fleste tumorundertrykkende gener en bred vifte af mulige tab af funktionsmutationer i hele genet og er som sådan ikke egnede til målrettet sekventering.

målrettede tilgange har fordelen ved at forstærke ctDNA gennem polymerasekædereaktioner (PCR) eller digital PCR. Dette er især vigtigt, når man analyserer ctDNA, ikke kun fordi der er relativt lave niveauer af DNA, der cirkulerer i blodbanen, men også fordi ctDNA udgør en lille del af det samlede cellefrie DNA, der ekstraheres. Derfor kan forstærkning af regioner af interesse drastisk forbedre følsomheden ved ctDNA-detektion. Amplifikation gennem PCR kan imidlertid introducere fejl i betragtning af den iboende fejlrate for DNA-polymeraser. Fejl indført under sekventering kan også mindske følsomheden ved at detektere ctDNA-mutationer.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Rediger

denne metode er afledt af den digitale PCR, oprindeligt navngivet af Bert Vogelsteins gruppe ved Johns Hopkins University. Droplet Digital PCR bruger en dråbegenerator til at opdele enkelte stykker DNA i dråber ved hjælp af en olie/vandemulsion. Derefter forekommer individuelle polymerasekædereaktioner i hver dråbe ved hjælp af udvalgte primere mod regioner af ctDNA og fortsætter til endepunkt. Tilstedeværelsen af sekvenserne af interesse måles af fluorescerende prober, som binder til det forstærkede område. ddPCR giver mulighed for meget kvantitativ vurdering af allel-og mutantfrekvenser i ctDNA, men er begrænset af antallet af fluorescerende sonder, der kan bruges i et assay (op til 5). Analysens følsomhed kan variere afhængigt af mængden af analyseret DNA og er omkring 1 ud af 10.000.

perler, emulgering, amplifikation og magnetik (strålende)Rediger

denne teknik bygger på dråbe Digital PCR for at identificere mutationer i ctDNA ved hjælp af strømningscytometri. Efter at ctDNA er ekstraheret fra blod, udføres PCR med primere designet til at målrette regionerne af interesse. Disse primere indeholder også specifikke DNA-sekvenser eller tags. Det forstærkede DNA blandes med streptavidinbelagte magnetiske perler og emulgeres til dråber. Biotinylerede primere designet til at binde til tags bruges til at forstærke DNA ‘ et. Biotinylering tillader det forstærkede DNA at binde til de magnetiske perler, som er belagt med streptavidin. Når PCR er afsluttet, adskilles de DNA-bundne perler ved hjælp af en magnet. DNA ‘ et på perlerne denatureres derefter og får lov til at hybridisere med fluorescerende oligonukleotider, der er specifikke for hver DNA-skabelon. De resulterende perle-DNA-komplekser analyseres derefter ved anvendelse af strømningscytometri. Denne teknik er i stand til at fange allel-og mutationsfrekvenser på grund af kobling med ddpcr. I modsætning til med ddPCR kan et større antal DNA-sekvenser imidlertid forhøres på grund af fleksibiliteten ved anvendelse af fluorescerende bundne prober. En anden fordel ved dette system er, at det isolerede DNA også kan bruges til nedstrøms sekventering. Følsomhed er 1,6 i 104 til 4,3 i 105.

kræft personlig profilering ved dyb sekventering Rediger

denne metode blev oprindeligt beskrevet af Ash Alisadeh og Maksimilian Diehn ‘ s grupper ved Stanford University. Denne teknik bruger biotinylerede oligonukleotidvælgerprober til at målrette DNA-sekvenser, der er relevante for ctDNA-detektion. Offentligt tilgængelige kræftdatabaser blev brugt til at konstruere et bibliotek med Sonder mod tilbagevendende mutationer i kræft ved at beregne deres gentagelsesindeks. Protokollen blev optimeret til de lave DNA-niveauer, der blev observeret i ctDNA-indsamling. Derefter gennemgår det isolerede DNA dyb sekventering for øget følsomhed. Denne teknik muliggør forhør af hundreder af DNA-regioner. CtDNA-detektionsfølsomheden af CPP-Sekv rapporteres at være 2,5 molekyler i 1.000.000.

Tagged AMplicon deep sekventering (TAM-Sekv)Rediger

TAM-Sekv tillader målrettet sekventering af hele gener til at detektere mutationer i ctDNA. Først udføres et generelt amplifikationstrin ved hjælp af primere, der spænder over hele genet af interesse i 150-200bp sektioner. Derefter bruges et mikrofluidiksystem til vedhæftede adaptere med en unik identifikator til hvert amplikon for yderligere at forstærke DNA ‘ et parallelt enkeltpleksreaktioner. Denne teknik blev vist med succes at identificere mutationer spredt i TP53 tumorundertrykkende gen hos avancerede ovariecancerpatienter. Følsomheden af denne teknik er 1 ud af 50.

sikker sekventering Rediger

denne metode blev oprindeligt beskrevet af Bert Vogelstein og hans gruppe ved Johns Hopkins University. Fejlfrekvensen for massivt parallel sekventering for at øge følsomheden over for sjældne mutanter. Det opnår dette ved tilføjelse af en unik identifikator (UID) sekvens til hver DNA-skabelon. DNA ‘et forstærkes derefter ved hjælp af de tilsatte UID’ er og sekventeres. Alle DNA-molekyler med samme uid (en uid-familie) skal have den samme rapporterede DNA-sekvens, da de blev forstærket fra et molekyle. Imidlertid, mutationer kan introduceres gennem amplifikation, eller forkerte basisopgaver kan kaldes i sekventerings-og analysetrinnene. Tilstedeværelsen af UID gør det muligt at adskille disse metodefejl fra ægte mutationer af ctDNA. En mutation betragtes som en ‘supermutant’, hvis 95% af de sekventerede læsninger er enige. Følsomheden af denne tilgang er 9 ud af 1 million.

Duplekssekvensredit

denne metode er en forbedring af de enkelte UID ‘ er, der er tilføjet i sikker Sekv-teknikken. I dupleksekventering fungerer randomiseret dobbeltstrenget DNA som unikke tags og er knyttet til en invariant afstandsstykke. Tags er fastgjort til begge ender af et DNA-fragment (α-og β-tags), som resulterer i to unikke skabeloner til PCR – en strand med en α-tag på 5′ ende og en β-tag på de 3′ ende og den anden strand med en β-tag på 5′ ende og en α-tag på 3’ – enden. Disse DNA-fragmenter forstærkes derefter med primere mod de invariante sekvenser af tags. Det forstærkede DNA sekventeres og analyseres. DNA med dupleksadaptere sammenlignes, og mutationer accepteres kun, hvis der er enighed mellem begge tråde. Denne metode tager højde for både fejl fra sekventering og fejl fra tidlig fase PCR-amplifikation. Følsomheden af tilgangen til at opdage mutanter er 1 i 10^7.

integreret digital Fejlundertrykkelse (ide ‘er)-forbedret CAPP-Sekredit

ide’ er forbedrer CAPP-Sekv-analysen af ctDNA for at mindske fejl og derfor øge detektionens følsomhed. Rapporteret i 2016 kombinerer iDES CAPP-Sekv med dupleks stregkodningssekvenseringsteknologi og med en beregningsalgoritme, der fjerner stereotype fejl forbundet med CAPP-Sekv hybridiseringstrin. Metoden integrerer også dupleksekventering, hvor det er muligt, og inkluderer metoder til mere effektiv dupleksgendannelse fra cellefrit DNA. Følsomheden af denne forbedrede version af CAPP-SEK er 4 i 100.000 eksemplarer.