Chp1 chromodomain binder H3K9me-halen og nukleosomkernen til at samle heterochromatin

plasmider og stammer konstruktion

Chp1CD-mutanter til ekspression og oprensning blev genereret gennem invers PCR ved hjælp af primere, der er anført i supplerende tabel S2 startende fra pET28a CHP1 Chromodomain plasmid . Heterochromatin rescue assays blev udført ved indføring af plasmider indeholdende chp1 vægt og chp1 mutantprotein under dets endogene promotor i en CHP1-larp-stamme (SP170, se supplerende tabel S3) . chp1-gen i fuld længde og dets endogene promotor (-949 bp fra starten af chp1+ kodningssekvens) blev klonet i pREP1-plasmidet. chp1 chromodomain mutanter blev genereret ved invers PCR under anvendelse af primere, der er anført i supplerende tabel S2 og transformeret i den angivne CHP1-larp-stamme.

til genomisk integration blev pREP1—plasmidet modificeret til at erstatte nmt1+- promotoren med følgende integrationskassette: (SphI) Region ved 5′ af Chp1—genet (kromosom i, 2215500-2215055) (AscI)—hphmks6-modstandskassette – (SphI) Chp1 endogen promotor (kromosom i, 2214829-2214664) – Chp1-kodningssekvens – (BamHI)) CHP1 Terminator (kromosom i, 2210976-2210582) (bamhi). Integrationskassetten (både chp1+ og chp1LOOP1B/2b kassetten) blev derefter PCR forstærket og transformeret ved elektroporation til sp101, SP170 og SP64 stammer. Celler blev derefter valgt på Ja + Hygromycin (50 mg ml−1 Hygromycin) plader. Enkeltkolonier blev isoleret, PCR screenet og sekventeret til genomisk indsættelse af hphmh6-modstandskassetten og LOOP1B/2b-mutationerne.

stammer indeholdende plasmider blev dyrket på Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu media. Alle Stammer og plasmider, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i supplerende tabeller S3 og S4.

proteinrensning

His6-SUMO-Chp1CD og alle CD-mutanter blev udtrykt i E. coli BL21 (DE3) (pLys) og oprenset gennem affinitetskromatografi ved hjælp af Ni-NTA-harpiks (GE Healthcare, Freiburg, Tyskland). His6-SUMO-Chp1CD indeholder thrombin spaltningssted mellem to tags .

i alt blev 0,2 mM IPTG tilsat for at inducere proteinekspression efterfulgt af vækst ved 18 liter C O/N. celler blev høstet ved centrifugering og opslæmmet i lysisbuffer (20 mM 4-(2-hydroksyethyl)-1-piperasinethansulfonsyre (HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 20 mM imidasol). Efter flashfrysning blev cellerne optøet og inkuberet i 30 minutter inden sonikering (Branson Sonifier 250-output 4, arbejdscyklus 40). Suspensionen blev centrifugeret (12000 g, 20 min ved 4 liter C) og supernatanten tilsat til ni-Nta-harpiksen, der var præ-ækvilibreret i bindingsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidasol) og inkuberet i 30 minutter ved 4 liter C under rotation. Harpiksen blev derefter vasket 5 liter med bindingsbuffer, og proteiner blev elueret i elueringsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidasol). Chp1CD vægt og mutanter blev derefter dyaliseret O / N i en buffer indeholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD blev derefter yderligere oprenset ved gelfiltrering (Superdeks 75 pg; GE Healthcare) og dialyseret i en buffer indeholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT.

Lyddæmpningsassays

celler til lyddæmpningsassays blev dyrket til en OD 0,7–1 og derefter normaliseret til en endelig koncentration på 1 liter 107 celler ml−1 af kultur. Ti gange serielle fortyndinger blev foretaget, så den højeste tæthedsplet indeholdt 1 liter 105 celler. Celler blev set på ikke-selektive (ja) og 5-fluororotinsyre (5-FOA 1 g l-1 5−FOA) plader. Pladerne blev inkuberet ved 32 liter C i 2-3 dage og afbildet. Celler har et ura4-reportergen indsat i pericentromere imr-gentagelser (heterochromatisk locus). Når ura4 reporter gen er tavs, kan celler vokse på 5-FOA indeholdende medium. Når heterochromatin går tabt, udtrykkes ura4-reportergen, og celler er ikke i stand til at vokse på 5-FOA-medium.

påvisning af RNA-niveauer ved hjælp af kpcr (RT–kpcr)

gærkulturer (10 ml) blev dyrket til en OD600 på 0,7-1,5. Celler blev derefter opslæmmet igen i 500 liter lysis buffer (300 mM NaOAc pH 5,2, 1% natriumdodecylsulfat) og 500 liter phenol–chloroform og inkuberet ved 65 liter C i 10 minutter med konstant blanding. Den vandige fraktion blev adskilt fra phenol–chloroform ved centrifugering (10 min, 20 000 g) og ethanol udfældet. Nukleinsyrer blev behandlet med DNAse i (Roche, Basel) i 30 minutter ved 37 liter C efterfulgt af 15 minutter ved 75 liter C varmeinaktivering. Komplementært DNA blev syntetiseret under anvendelse af 100 ng RNA og 1 pmol DNA-oligos med Superscript III (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) under anvendelse af standardbetingelser. RNA-niveauer blev kvantificeret ved hjælp af DyNAmo-Flash-PCR-kittet og normaliseret til euchromatisk gen tdh1.

RNA-elektroforetiske mobilitetsskiftassays

RNA-shiftassay blev udført efter de tidligere rapporterede tilstande . I alt 0.66 pmol ‘ er af 32P radiomærket 30 NT centromerisk RNA blev inkuberet med 10 liter Chp1 chromodomain (vildtype og mutant) i en buffer indeholdende 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT og 3% Glycerol. For RNA EMSA med 100 NT DG centromere transkripter blev 2 pmol ‘er af 32P radioaktivt mærket RNA inkuberet med 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmol’ er af Chp1CD-protein (vægt-og LOOP1B/2B-mutant) i slutvolumen på 15 liter. H3k9me3-peptid (Eurogentec, K Larsln, Tyskland) blev tilsat ved et 1:1 Chp1CD – H3K9me-peptid, som rapporteret i . Inkubation blev udført i 1 time på is, og prøver (20 liter slutvolumen) blev derefter indlæst på en 10% acrylamid-TBE Native gel (Bis-Acrylamidforhold 1:29). Til in vitro-RNA-nedtrækningerne blev 1 liter SUMO-Chp1CD (vildtype og LOOP1B/2b-mutant) bundet til 15 liter ni-Nta-harpiks (GE Healthcare), og H3k9me3nucleosomet blev tilsat for at samle Chp1CD-H3k9me3nucleosomkomplekset i Bindingsbuffer (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidasol). Efter vask tre gange med 50 liter bindingsbuffer blev 2 pmoler af 32P-mærket 100nt DG RNA tilsat og inkuberet med Chp1CD-Nukleosomharpiksen på is i 1 time. harpiksen blev centrifugeret ved langsom hastighed (60 g, 10 s) og gennemstrømningen opsamlet. Harpiksen blev vasket i tre gange med mindst 3 liter (v/v) Bindingsbuffer, og Chp1CD-nukleosom-RNA-komplekset blev elueret ved tilsætning af 300 mM imidasolbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM imidasol), inkuberet i 1 time på is med 5 min intervalblanding (bundet fraktion). Prøver blev indlæst på en 10% TBE-Nativ Acrylamidgel (Bis-Acrylamidforhold 1:29) og kørt i 2 timer ved 10 mA ved 4 liter C. efter eksponering natten over blev geler scannet ved hjælp af TyphoonFLA9000 phosphoimager.

Kromatinimmunudfældning

gærkulturer (100 ml) blev dyrket til en OD600 på 0,7 og tværbundet med 3% formaldehyd ved stuetemperatur i 15 minutter som beskrevet . Reaktionen blev standset med 125 mM glycin i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev re-suspenderet i 500 lysis-buffer (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 M natriumacetat, 5 mM MgCl2, 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre, 2 mM ethylenglycol tetraeddikesyre, 0,1% NP-40, 20% glycerol) indeholdende proteasehæmmere (proteasehæmmere cocktail tabletter, Roche, komplet, ethylendiamintetraeddikesyre fri). Frosne celler blev lyseret ved hjælp af MP Biospec bead beater. Efter lysis blev ekstraktet sonikeret 35 liter i 30 sekunder (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgien) og spundet ved 13 000 g i 15 minutter for at opnå kromatin-supernatanten. Til input-DNA blev der anvendt 50 liter af supernatanten. For immunopræcipitationer blev supernatanterne normaliseret baseret på proteinkoncentrationen og inkuberet med anti-dimethyleret H3K9-antistof eller anti-Chp1-antistof (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 og Chp1, Abcam-nr. Ab18191), immobiliseret på magnetiske Dynabeads, i 2 timer ved 4 kg C. perlerne og immobiliseret protein blev vasket 5 kg med 1 ml lysisbuffer. Proteiner blev elueret ved inkubation med 150 liter elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre, 1% natriumdodecylsulfat) ved 65 liter C i 15 minutter. Tværbindinger blev reverseret ved inkubation ved 65 liter C natten over efterfulgt af RNA–nedbrydning med RNase A og proteinnedbrydning med Proteinase K. DNA blev derefter genvundet ved phenol-chloroformekstraktion og ethanoludfældning og kvantificeret ved anvendelse af kpcr. Euchromatisk gen tdh1 blev anvendt til normalisering. Oligonukleotider anvendt i kromatinimmunudfældning assays er anført i supplerende tabel S2.

nukleosomer in vitro rekonstitution og (H3K9me3) methylering

nukleosomer blev rekonstitueret ved anvendelse af histoner og 601-sekvensen som tidligere beskrevet . In vitro-methylering blev udført som beskrevet . Toppen ved +42 Da er blevet observeret i den oprindelige publikation, og det er ikke en forurening (Matt Simon, personlig kommunikation og beskrevet i ).

in vitro Chp1CD-H3K9me3 MLA-Nukleosomkompleksdannelse og eluering

i alt blev 5 liter Chp1CD bundet til 15 liter Ni-Nta-harpiks i bindingsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidasol) i 20 minutter ved 4 liter C. Harpiksen blev vasket en gang med fem volumener bindingsbuffer og 10 liter h3k9me3 methyllysinanalog (MLA) nukleosomer blev tilsat (MLA nukleosomer blev tidligere dialyseret i bindingsbuffer) i et slutvolumen på 20 liter og inkuberet 1 time på is med konstant re-suspension hvert 5.minut. Efter inkubation blev harpiksen centrifugeret (60 g i 10 s) og gennemstrømningen opsamlet. Harpiksen blev derefter vasket tre gange med fem volumener bindingsbuffer. SUMO-Chp1CD-H3k9me3nucleosomkomplekset blev elueret ved tilsætning af thrombin (Sigma, Munich, Tyskland) i 2 timer på is i 20 liter bindingsbuffer. Kompleks dannelse blev derefter vurderet gennem SDS-polyacrylamidgelelektroforese på 15% acrylamidgeler og ved negativ plet EM.

Chp1CD H3K9me3 peptidbindende assays

i alt blev 1 liter-Histon H3 (1-21)- GGK(Biotin) peptid (Eurogentec) inkuberet med 15 liter streptavidin agaroseharpiks (Invitrogen) i 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. Cirka 5 liter Kraftvarme1cd (både vægt og mutanter) blev derefter tilsat i et slutvolumen på 20 liter og inkuberet i 1 time på is under de samme bufferbetingelser. Harpiksen blev vasket tre gange, og derefter blev bindingseffektiviteten vurderet på SDS-polyacrylamidgelelektroforese på 15% acrylamidgeler. Kvantificering af binding blev udført ved hjælp af ImageJ-programmet. Binding af hver mutant blev normaliseret til vægt Chp1CD for hvert assay.

mikroskala termoforese (MST)

for MST SUMO tag blev fjernet fra Chp1CD konstruktioner med Ulp1 protease. I alt blev 100 liter vildtype og mutant Chp1CD fluorescerende mærket ved hjælp af Mo-L003 Monolith Protein Labeling Kit BLUE-NHS (Amine Reactive) i henhold til producentens anvisninger (Nanotemper Technologies, Munich, Tyskland). En 1: 1 fluorescens: Protein ratio blev estimeret ved hjælp af Nanodrop1000 program ‘proteiner og etiketter’ funktion og hver Chp1 Chromodomain blev kørt på en 15% SDS acrylamid gel til at normalisere koncentrationer til 0,1 mg ml−1.

reaktionerne blev samlet i 20 liter med 300 ng fluorescerende Chp1CD og stigende mængder af-histon H3 (1-21)-GGK(Biotin) peptid (Eurogentec) eller H3k9me3nucleosomer i en buffer indeholdende 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT og 0,05% mellem-20. For H3k9me3nucleosomer-bindende assays glycerol blev tilsat til 10% endelig koncentration. Til h3k9me3-analyser blev disse fortyndinger anvendt til målinger: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 liter, 800 liter, 1,2 liter, 1,8 liter. Til h3k9me3nucleosomanalyse brugte vi følgende fortyndinger til målinger: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 liter, 1,2 liter, 1,4 liter, 1,6 liter, 2,4 liter.

MST-kørsler blev udført ved hjælp af standardbehandlede kapillærer (Nanotemper Cat#K002) på NT.115 monolit instrument. Alle målinger blev udført ved hjælp af 80% LED og 40% MST effekt, med 30 s Laser til tiden og 5 s Laser slukket tid. For hvert forsøg blev der udført fem enkeltmålinger.

Data blev analyseret med GraphPad Prism-programmet version 6.00 (GraphPad, San Diego, CA, USA) og SigmaPlot-programmet version 13.0 (Systat, San Jose, CA, USA). For peptid-bindende assays, med kurverne viser en distinkt sigmoid tendens, vi monteret Richards fem Parameter logistisk asymmetrisk sigmoidal ligning og automatisk beregnet Kd. For h3k9me3nucleosombindende assays, da rådatatendensen ikke længere var sigmoid for alle analyserede proteiner, blev en tredje ordens polynom (kubisk) ligning anvendt til montering og sammenligning af rådatapunkterne for vildtype Chp1CD og de forskellige mutanter. Kd blev beregnet ud fra’ Interpolation ‘ – funktionen i GraphPad prism-programmet ved hjælp af 50% bundet/ubundet værdi på y-aksen.

Nukleosomtrypsinfordøjelse

Tailless nukleosomer blev fremstillet ved inkubering af rekonstituerede nukleosomer med en immobiliseret tpck-Trypsinharpiks (Termovidenskabelig) i 2 timer ved stuetemperatur i en buffer indeholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT . Den tryptiske fordøjelse genererer meget definerede histonbånd, og det er blevet karakteriseret detaljeret, hvor nøjagtigt trypsin skærer .

Nukleosombindende assays med Chp1CD mutanter

Chp1CD vildtype og mutant nukleosombindende assays blev udført som beskrevet tidligere for Chp1CD-H3KC9me3 MLA Nukleosomkompleksdannelse i 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM imidasol. Harpikser og input blev kørt på SDS-polyacrylamidgelelektroforese 15% acrylamidgeler. Alle prøver blev derefter analyseret af immunoblot med anti-H3 histon (AbCam, Cambridge, UK, 1:1000) eller anti-H3K9me3 antistof (AbCam, 1:1000), Anti-ged IgG-HRP (BioRad, 1: 3000) Anti-kanin IgG-HRP (BioRad, Munich, Tyskland, 1:3000).

negativ pletelektronmikroskopi

efter trombin eluering blev 3 liter af Chp1CD–H3KC9me3 nukleosomerkomplekset spottet på et glødudladet Kobbergitter (Cu 400 mesh 11916, Kvantifoil, Gro Karbonfilm i 45 s. efter en hurtig vask med vand blev gitteret inkuberet i 15 s i 2%, Og det blev uranylacetat. Negative pletbilleder blev samlet på et FEI Morgagni transmissionselektronmikroskop.

Cryo-EM på Chp1CD–H3KC9me3 nukleosomer kompleks

Cryo-EM gitre (Holey carbon-coated gitre, Cu 300 Mesh R3/3+1 nm carbon lag, Kvantifoil) blev fremstillet under anvendelse af en Vitrobot Mark IV (FEI Company). Cryo-EM-data blev indsamlet ved hjælp af et Titan-Krios transmissionselektronmikroskop (FEI Company, Hillsboro eller USA) ved 200 KeV og en forstørrelse på 113 000 liter ved CCD ‘ ens plan ved hjælp af et f816 CMOS-kamera (TVIPS GmbH, Gauting, Tyskland), hvilket resulterede i en billedpunktstørrelse på 1,2 liter pr. Til automatisk dataindsamling blev EM-TOOLS-programmet brugt, og data blev indsamlet i et defokusområde på 10 000-40 000 liter.

i alt blev 2 480 mikrografer til Chp1CD–H3KC9me3-komplekset og 991 mikrografer til h3kc9me3-nukleosomkontrollen udvalgt til enkeltpartikelanalyse ved hjælp af Programmelpakken (supplerende figur S9A) . Få tusinde partikler blev manuelt plukket og omhyggeligt rengjort fra støj. Disse partikler blev derefter brugt til halvautomatisk og automatisk partikelplukning. Kontrastoverførselsfunktion blev bestemt af CTFFIND3 . Udvalgte enkeltpartikler blev konverteret til SPIDER-og RELIONFORMATER til yderligere analyse (supplerende figur S9B). De to-dimensionelle klassegennemsnit blev genereret med RELION programpakke (supplerende figur S9C) . Dårlige klassegennemsnit blev fjernet fra yderligere dataanalyse. De tre-dimensionelle forbedringer blev efterfølgende gjort med SPIDER og RELION programpakker .

ikke-overvåget partikelklassificering blev udført ved tilfældig såning med de komplette tæthedskort uden fokuseret klassificering i SPIDER-programpakken. Forsøg på at bruge fokuseret klassificering resulterede i en stærk bias og støjoverfitting i regioner af interesse. Derfor brugte vi ikke fokuseret klassificering for at reducere bias. I den indledende klassificering udført i SPIDER blev klasserne C0–C6 og N0-N5 tilbageprojiceret ved hjælp af vinkler fra C0-og N0-kort, og disse klasser blev ikke fuldt raffineret. Her ville vi bare vælge klasser, der havde yderligere tæthed bundet til nukleosomet. Partikler, der genererede kort med forskellige Chp1CD-tætheder, blev adskilt og yderligere klassificeret. 20 runder af tilfældige såningsklassifikationer blev udført, indtil vi har opdelt partikler i fem forskellige grupper (supplerende figur S3). Klasse C11-C15 blev raffineret med RELION programpakke. Endelige forbedringer af Chp1CD-H3k9me3nucleosomkomplekser (C15 klasse) og Nukleosomkontrol blev udført med RELION programpakke. For endelig raffinement reference blev filtreret til ~50 liter (RELION filter). Den reference, vi brugte, havde ingen af de funktioner, der blev observeret i raffinerede rekonstruktioner (DNA-dobbeltspiralen er ikke løst, større rille er ikke synlig, kur-helices er ikke løst). Dette indikerer ingen referenceforstyrrelse i vores struktur. Opløsningen af Nukleosomkontrol nåede 7,3 liter ved hjælp af auto-forfine i RELION og C2 symmetri (FSC 0,143 cutoff af to uafhængigt raffinerede kort). Chp1CD-H3k9me3nucleosomkompleks blev raffineret til 10 liter (FSC 0.143 cutoff af to uafhængigt raffinerede kort) uden symmetri anvendt.

lokal opløsning blev beregnet ved hjælp af ResMap-programmer (final single volume, minRes=7, maks=14, automask). Den gennemsnitlige opløsning bestemt af Resmap er 9,4 liter for Chp1CD-H3k9me3nucleosomkompleks, der uafhængigt bekræfter tidligere bestemt gennemsnitlig opløsning på 10 liter (FSC 0,143) (figur 1C). For Chp1CD-H3k9me3nucleosomkompleks lokal opløsning for nukleosomet er 9-10 liter og for liganden ~10 liter (figur 2a). Euler vinkelfordeling for endelige rekonstruktioner er vist for både nukleosomet og Chp1CD-H3k9me3nucleosomkompleks (supplerende figur S9D). Alle orienteringer er til stede med en præference for top-og sidevisninger.

molekylære modeller blev bygget ved hjælp af Chimera programpakke ved hjælp af stiv krop montering af krystalstrukturer . Tilpasningen til densitet blev udført med Chimera-indstillinger ‘Fit in Map’ og ‘Fit in Segments’ med kun mindre manuelle justeringer. Segmentering og visualisering af alle cryo-EM-kort blev også udført med Chimera-programmer .