Chimerismetest anvendes til rutinemæssig dokumentation af engraftment og opfølgning efter transplantation af allogene transplantationsmodtagere. Donor-og modtagerceller kan skelnes ved at teste genetiske markører, der bestemmes inden transplantationen.2 i køn-uoverensstemmende transplantationer når modtageren og donoren er af forskellig køn, bestemmes andelen af kvindelige og mandlige celler normalt ved analyse af kønskromosommarkører, oftest med fisk.8,9 vurdering af variabelt antal tandem-gentagelser (VNTR) eller korte tandem-gentagelser (STR) ved PCR er blevet den mest værdifulde metode til bestemmelse af kimærisme i kønsmatchede transplantationer.10 forskellige metoder er blevet udviklet til påvisning af MRD. Morfologisk analyse af marven kan identificere resterende sygdom, der optager mere end 5% af marvrummet og mangler således den nødvendige følsomhed til tidlig påvisning. Det er også ofte vanskeligt at differentiere en lille leukæmieksplosionspopulation fra normale donorafledte hæmatopoietiske eksplosioner, der genbefolker marven uden at bruge yderligere markører. Specifikke tests kan detektere MRD, når der er en specifik tumormarkør, såsom en specifik cytogenetisk abnormitet, en specifik immunofenotype, der kan identificeres ved FACS, specifikke DNA-eller RNA-sekvenser, der kan forstærkes ved PCR eller et specifikt vækstmønster i klonogene analyser. I fravær af en specifik tumormarkør til MRD kan kimærismetest anvendes til at detektere modtagerafledte celler. Påvisningen af recipientafledte celler korrelerer muligvis ikke altid med risikoen for tilbagefald. Modtagerceller, der bidrager til blandet kimærisme (MC) hører til den ondartede klon eller kan være normale hæmatopoietiske celler eller endda stromaceller. I løbet af de første par uger efter standard allogen transplantation kan modtagerceller stadig påvises, når der anvendes følsomme tests.9,11 disse er for det meste T-celler, der overlever konditioneringsregimen. Værtsceller kan påvises ved lave niveauer (<1%) endnu senere i posttransplantationsforløbet. MC detekteres oftere efter ikke-myeloablativ konditionering.2 således er tumorspecifikke markørprober sandsynligvis overlegne og mere nøjagtige end kønsmatchprober til påvisning af MRD.12 selv påvisning af MRD med tumorspecifikke tests kan imidlertid ikke altid være korreleret med risikoen for tilbagefald. Positive PCR-test for BCR/ABL er rapporteret hos raske individer.13 T (14; 18) translokationen blev påvist i andre slægter end B-lymfocytter hos patienter med ikke-Hodgkins lymfom.14 der kan være en tærskel for MRD at være klinisk signifikant. I flere sygdomme, såsom AML med t (8;21) er der observeret 15 langvarige remissioner i nærvær af MRD påvist ved PCR, mens PCR-positivitet i andre, såsom ved akut promyelocytisk leukæmi, forudsiger tilbagefald.16 igen kan dette være relateret til følsomheden af den specifikke PCR-test og tærsklen til klinisk betydning. Resterende maligne celler kan have en sovende status17 mangler potentialet til at bidrage til tilbagefald på grund af manglende eller gevinst ved en anden genetisk ændring. I nogle sygdomme kan der forekomme delvis differentiering til mere modne celler, og disse celler kan mangle potentialet til at sprede sig. MRD kan være under immunovervågning, eller MRD-cellerne er i en apoptotisk fase, hvilket gør dem irrelevante for tilbagefald af sygdomme. De følsomme PCR-test bevarer ikke cellulær morfologi, og det er derfor uklart, hvilke celler der korrelerer med MRD i disse forskellige omgivelser.
Duet-systemet til kombineret samtidig morfologisk og cytogenetisk multiparametrisk analyse giver et par fordele, der kan hjælpe med at afsløre relevansen af MRD-detektion. 150000 celler pr. dias) efter små cellulære undergrupper med unik cytogentisk eller immunfænotype. Følsomheden til påvisning af små populationer øges. I en række fortyndingseksperimenter har vi vist, at følsomheden til påvisning af en hancelle i en kvindelig cellepopulation er højere end 1:50000, men på grund af begrænset specificitet i denne titer forekommer den bedste detektion mellem 1:10000 og 1:50000 (se tillæg). Som det ses i analysen af knoglemarvsprøver fra patient 1 (sidste analyse) og patient 2, kunne duet-systemet detektere meget små populationer af modtagerceller, der ikke blev detekteret af rutinefisk. Den kvantitative nøjagtighed af fisk er afhængig af den observerede frekvens og antallet af celler scoret, således forbedret ved at score flere celler.18 at score et så stort antal celler er ikke praktisk med manuel fisk, men det automatiske Duet-system er i stand til at scanne 10000 celler/min i lysfeltmikroskopi og 2000-10000 celler/h i fluorescerende mikroskopi, hvilket understøtter behovet for hurtig og effektiv scanning og øget følsomhed.
følsomme tests er ofte forbundet med reduceret specificitet og en relativt høj falsk positiv rate. Med standardfisk kan falsk positiv scoring forekomme på grund af ikke-specifik hybridisering af sonden. Falsk positiv scoring for kromosomale translokationer kan forekomme på grund af tilfældig rumlig tilknytning og optisk fusion.18 Duet Kurt-systemet kan potentielt forbedre specificiteten ved at identificere morfologien af cellerne i den søgte population. Påvisning af FISKEPOSITIVITET, i en lille population, men med en ensartet Duet, gør det mere sandsynligt, at det er en sand positiv, end når positive celler er spredt inden for forskellige, ikke-relaterede slægter. Specificiteten af påvisning af MRD med uspecifik kimærisme test kan også forbedres. Som diskuteret ovenfor kan modtagerceller tilhøre den ondartede klon (som hos patient 1), kan være normale hæmatopoietiske celler (patient 3, patient 1 efter behandling med STI571) eller ikke-hæmatopoietiske/stromale celler (såsom osteoblaster, patient 2). Duet prist-systemet tillader differentiering mellem disse muligheder ved det morfologiske udseende. Vi har vist i analysen af patient 1 og to yderligere patienter (data ikke vist), at identifikation af modtageregenskaber (såsom modsat køn cytogenetik) inden for blaster eller umodne celler forudsiger åbenlyst tilbagefald og går forud for det med et par uger til et par måneder. I patient 1 afslørede separate FISKEANALYSER en lille modtagerpopulation (0,6%) og en lille BCR/ABL-positiv population (0,8%), som begge kunne overvejes inden for den falske positive rate af FISKEANALYSEN. Duet-systemet har imidlertid vist, at en stor del af modtagercellerne var blaster (og også BCR/ABL positive ved en anden FISKETEST på de samme celler) og kunne således forudsige, at patienten er bestemt til at komme tilbage. Identifikationen af en lille modtagerpopulation inden for modne hæmatopoietiske celler forudsiger muligvis ikke tilbagefald. Hos tre yderligere patienter (data ikke vist) har vi dokumenteret kontinuerlig remission i nærvær af en lille modtagerpopulation med moden morfologi. Større skalaundersøgelser med længere opfølgning er nødvendige for at bekræfte sammenhængen mellem morfologi af resterende værtsceller og tilbagefaldsrisiko hos patienter uden andre unikke markører for den ondartede klon.
systemet er relativt enkelt at betjene, er for det meste automatisk, dets udvidelsestid og omkostninger kan sammenlignes med andre systemer til kimærisme og MRD-detektion såsom standardfisk og PCR, og det kan være egnet til storskala test. Bortset fra systemets udstyr og sæt er der kun brug for standardudstyr, der er let tilgængeligt i store laboratorier (se tillæg).
i de senere år har undersøgelsen af kimærisme inden for forskellige cellulære undergrupper fået interesse og popularitet.19,20 dette er af største betydning efter ikke-myeloablative transplantationer.2 Det er blevet vist af nogle grupper, at fuldstændig kimærisme inden for T-lymfocytterne er nødvendig til induktion af GVL, og derfor kan MC i denne cellulære delmængde være forbundet med øget risiko for tilbagefald, især af aggressive, hurtigt voksende maligniteter.2,19 Chimerismetestning af cellulære undergrupper kræver besværlig og tidskrævende sortering af celler med det teoretiske potentiale til at miste nogle celler under denne proces. Som diskuteret i tillægget forårsager forberedelsen af dias til duet-kursanalyse ikke tabt eller reduktion af nogen cellulær population. Duet-systemet bruger MGG-farvet dias til at lokalisere lymfocytter og andre cellulære undergrupper og kan også bruge immunocytokemiske pletter (såsom anti-CD3 monoklonale antistoffer) til at lokalisere disse celler. I en anden fase, fisk kan anvendes til kimærisme test i køn-uoverensstemmende transplantationer. Sagspræsentationen af patient 3 viser, hvordan systemet blev brugt til at følge kimærisme hos en patient efter ikke-myeloablativ transplantation, og hvordan konvertering til komplet kimærisme efter tilbagetrækning af cyclosporin forudsagde forekomsten af GVHD-og GVT-responser.
denne rapport fokuserer på brugen af duetkrus efter knoglemarvstransplantation, men der kan være mange andre implikationer. Systemet kan også hjælpe med at studere celler og slægter, der har en unik cytogenetisk eller immunofenotypisk markør, såsom BCR/ABL-fusion (som set hos patient 1) og korrelere deres morfologi med tilbagefaldsrisiko efter standard kemoterapi. Det kan hjælpe med at afsløre arten af MRD i forskellige maligniteter, og hvorfor MRD-detektion ikke altid er forudsigelig for tilbagefald. I visse indstillinger kan der søges små donorcellepopulationer eller mikrokimerisme. For eksempel kan systemisk lymfo–hæmatopoietisk mikrochimerisme detekteret efter FAST organtransplantation forudsige tolerance over for det transplanterede organ og lede den immunsuppressive terapi.21 lille moderpopulation, der kontaminerer ledningsblodallotransplantater, kan også påvises på en lignende måde og kan have konsekvenser for posttransplantationsrisiko for GVHD.
ved at tilføje morfologisk analyse af små populationer af celler med malignitet eller modtagerassocierede markører kan Duet-systemet forbedre nøjagtigheden af kimærisme og MRD-test og afgrænse deres kliniske betydning. Dette system fortjener yderligere undersøgelse i større skala forsøg.