1.4.1 Homogeniseringsmedium
Celleforstyrrelse udføres normalt i enten et let hypo-osmotisk eller et iso-osmotisk medium for at bevare morfologisk integritet. Saccharose anvendes almindeligvis som et osmoticum for at forhindre subcellulære organeller eller vesikler fra negativ hævelse eller krympning. Mannitol og sorbitol er også blevet anvendt, når saccharose har vist sig at interferere med den biokemiske analyse af den subcellulære komponent. Saccharose foretrækkes frem for saltopløsninger, fordi sidstnævnte har tendens til at aggregere subcellulære organeller. Hypo-osmotiske medier bruges ofte til isolering af plasmamembranfraktioner, fordi forstyrrede celler under disse betingelser giver plasmamembraner i form af store spøgelser eller ark. Dette reducerer signifikant den høje grad af variation i størrelse af disse fragmenter før centrifugering. Selvom homogeniseringsmediet sædvanligvis er vandigt, er ikke-vandige medier, såsom ether/chloroform, blevet anvendt til at isolere subcellulære organeller. Imidlertid kan ikke-vandige medier inaktivere nogle af dem og reducere morfologisk integritet af nogle væv.
chelateringsmidler (EDTA eller EGTA) kan tilsættes til homogeniseringsmediet for at fjerne divalente kationer, såsom Mg2+ eller Ca2+, som kræves af membranproteaser. Det er vigtigt at bemærke, at proteasehæmmere stadig skal inkluderes i mediet, fordi EDTA-og thiolreagenser kan aktivere nogle proteolytiske stoffer. Imidlertid kræver mange membranmarkørtyper disse kationer for aktivitet og kan hæmmes, efter at kationerne er fjernet fra ekstraktet. Tilsætningen af Mg2 + eller Ca2+ til homogeniseringsmediet opretholder nuklear integritet. Imidlertid kan disse ioner forårsage membranaggregering og mindske respiratorisk kontrol i mitokondrier.
celleforstyrrelse af plantevæv frigiver ofte phenoler, som kan have flere skadelige virkninger på plantesymmer. Plantefenolforbindelser omfatter i det væsentlige to grupper: phenylpropanoidforbindelser (f.eks. hydrolyserbare tanniner) og flavonoiderne (f. eks. kondenserede tanniner). Det kan også være en af de mest almindelige typer proteiner, der findes i kroppen. Kinoner er kraftige iltningsmidler, der også har tendens til at polymerisere og kondensere med reaktive grupper af proteiner for at danne et mørkt pigment kaldet melanin, som danner grundlaget for bruning af plantevæv. Vedhæftning af melanin til proteiner kan inaktivere mange Fermes. De kan danne Ioniske interaktioner med basiske aminosyrer af proteiner eller interagere hydrofobt med hydrofobe regioner af proteiner. Derfor er det vigtigt at fjerne phenolforbindelserne så hurtigt som muligt, og dette opnås bedst ved at bruge adsorbenter, der binder til phenoler eller kinoner, eller ved at bruge beskyttelsesmidler, såsom Borat, germanat, sulfitter og mercaptobensothiat, der hæmmer phenoloksidaseaktiviteten. Phenoladsorbenten, polyvinylpyrrolidon i enten vandopløselig form eller som det stærkt tværbundne uopløselige produkt ‘Polyclar’ kan sættes til isolationsmediet. Polyvinylpyrrolidon binder de phenolforbindelser, der danner stærke hydrogenbindinger med proteiner. Bovint serumalbumin er også rapporteret at reagere med plantefenoler og er også en effektiv kinonopsamler.
celle-eller vævsfraktionering udføres uvægerligt ved +4 liter C for at reducere aktiviteten af membranproteaser. Proteaser kan opdeles i endopeptidaser og eksopeptidaser. Endopeptidaser, der spalter interne peptidbindinger, inkluderer: syreproteaser, der har en pH–optima på pH 2,5-3,8 og kan hæmmes af overgangstilstandshæmmeren pepstatin; serinproteaser, der kan hæmmes af diisopropylfluorphosphat og phenylmethylsulfonylfluorid; og sulfhydrylproteaser, der hæmmes af N-ethylmaleimid eller E-64 (L-trans-epoksysuccinyl-leucylamid-butan). Eksempler på eksopeptidaser inkluderer carboksypeptidaser, der er til stede i de fleste plantevæv og let hydrolyserer de fleste C-terminale aminosyrer. Alle plantekarboksypeptidaser, der er undersøgt til dato, hæmmes af diisopropylfluorophosphat. Aminopeptidaser, dipeptidaser og tripeptidaser er også blevet identificeret i planter. Andre forbindelser, der anvendes i homogeniseringsmedier, inkluderer disulfidreducerende midler, såsom 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, dithioerythritol, reduceret glutathion eller cystein. Dette skyldes, at mange sulfhydrylgrupper indeholder en essentiel aktiv sulfhydrylgruppe, der skal forblive reduceret for at opretholde aktiviteten. Mange af problemerne med organelleisolering er forbundet med brud på de skrøbelige membraner, for eksempel tonoplasten, der omgiver vakuolen. Bortset fra den fysiske ødelæggelse af disse membraner indeholder plantevæv aktive lipolytiske stoffer, som kan angribe lipidkomponenterne i membraner direkte og forstyrre organeller. Frie fedtsyrer frigivet ved den hydrolytiske virkning af acylhydrolaser kan hæmme ATPase-aktiviteter af mitokondrier, chloroplast og plasmamembran. Andre skadelige virkninger af fedtsyrer er også veletablerede. Der er visse tilstande, der kan reducere lipidnedbrydning ved lipaser og lipolytiske acylhydrolaser i planter. Disse inkluderer anvendelse af (1) et isolationsmedium med en pH på 7.5-8, hvor de fleste lipolytiske stoffer og lipooksygenaser udviser ringe aktivitet, (2) chelateringsmidler, såsom EDTA, fordi mange phospholipaser er Ca2+-afhængige; mange lipolytiske stoffer påvirkes imidlertid ikke af chelateringsmidler og (3) andre tilsætningsstoffer, såsom antioksidanter for at forhindre nedbrydning af fedtsyrehydroperoksider, disulfidreducerende midler, specifikke hæmmere og brugen af fedtsyrefri bovint serumalbumin, der binder frie fedtsyrer. Hvert enkelt homogeniseringsmedium er forskelligt og kan indeholde specifikke inhibitorer, såsom phospholipaser eller phos-phataser. Glycerol tilsættes for eksempel ofte til isolationsmediet for at hæmme phosphatidsyrephosphatase. Ethanolamin og cholinchlorid anvendes almindeligvis til at hæmme phospholipase D.
bufferkapaciteten af homogeniseringsmediet til plantecellefraktionering skal være høj for at udligne frigivelsen af organiske syrer af den forstyrrede vakuol, som udgør et betydeligt volumen af cellen. Homogeniseringsmediet kan enten formuleres ved empirisk evaluering eller ved rationel analyse. For eksempel for at sikre, at det relevante oprensede protein forbliver intakt, kan alle større inhibitorer af proteaser sættes til homogeniseringsmediet, eller alternativt kan fysiologiske opløsninger kopieres. Da plantecellens cytoplasmatiske pH er omkring 7,5-8,0, bør homogeniseringsmediet afspejle cellens fysiologiske tilstand og er derfor svagt bufret til den cytoplasmatiske pH.