i denne video vil du observere, hvordan du udfører chromfrigivelsesassayet og bestemmer effektorcellernes cytotoksiske potentiale.
immunceller er ansvarlige for at identificere og fjerne potentielt skadelige celler, som kræft eller virusinficerede celler, fra kroppen, som er en integreret del af immunresponset. Flere immunceller, som T-celler og NK-celler, besidder en egenskab kendt som cytotoksisk potentiale, som er evnen til at identificere målceller og udskille proteiner, der inducerer proteinnedbrydning, lysis og død af disse målceller. Kvantificering af cytotoksisk potentiale er kritisk til måling af immuncelleaktivering og styrke, og kromfrigivelsesanalysen bruges ofte til dette formål.
denne metode gør det muligt for brugere at sammenligne cytoksicitet induceret af specifikke typer immunceller under forskellige forhold, hvilket er værdifuldt til at studere kræftimmunterapi og immunitetsrelaterede sygdomme. Til at begynde med inkuberes målcellerne, ligesom kræftceller, med en radioaktiv isotop, chrom 51, som optages af cellerne. Dernæst dyrkes disse radiomærkede celler sammen med de isolerede immunceller af interesse, også kaldet effektorcellerne, i en rund bund, 96 – brøndsplade for at lette interaktionen mellem de to celletyper.
den samlede opsætning af analysen involverer inkubering af et specifikt antal målceller med forskellige koncentrationer af immuncellerne sammen med passende kontroller. Samkulturen tillader effektorcellerne at inducere apoptose og lysis i målcellerne, hvilket resulterer i frigivelse af det intracellulære chrom 51 i supernatanten. Derefter høstes supernatanten, der indeholder det frigivne krom, på et præoptimeret tidspunkt fra alle brøndene. Chrom 51, Der er radioaktivt, gennemgår spontant radioaktivt henfald for at udsende gammastråling. Gammastrålingsniveauerne i supernatanterne fra alle brøndene i analysepladen repræsenterer en kvantificerbar output af lysis af målcellerne. Dette måles ved hjælp af en gammatæller, som derefter bruges til at bestemme immuncellernes cytotoksiske potentiale.
til at begynde med fremstilles målcellerne, human melanomcellelinie MASSE793 i dette eksempel til en enkelt cellesuspension. For at gøre dette skal du først fjerne medierne fra vævskulturkolben og vaske cellerne med fem milliliter 1 gange PBS. Dekanter PBS, og tilsæt derefter en milliliter trypsin til pladen i cirka to minutter. Bank forsigtigt på kolben for at løsne cellerne fra kolbeoverfladen og tilsæt derefter fem milliliter RPMI-medier til kolben. Pipette medierne op og ned for at samle cellerne og tilføje denne suspension til et 15 milliliter konisk rør.
anbring røret i centrifugen i fem minutter ved 1200 omdr. / min. Fjern derefter mediet fra røret og sørg for ikke at forstyrre cellepelleten. Svirp forsigtigt bunden af røret for at forstyrre cellepelleten og tilsæt 10 ml medier til røret. Derefter pipetteres medierne forsigtigt op og ned for at bringe cellerne i suspension. Bestem derefter cellekoncentrationen ved hjælp af et hæmocytometer og overfør to milliliter af den oprindelige cellesuspension til et nyt 15 milliliter konisk rør. Placer røret i en centrifuge og pellet cellerne ved 12 hundrede omdr. / min. i fem minutter. Efter centrifugering hældes overskydende medier ud af røret i en affaldsbeholder. Hvirvler kort røret for at resuspendere cellepelleten i det lille volumen af medium, der er efterladt.
forbered dig derefter på at bruge chrom 51 ved at flytte til et laboratorierum dedikeret til denne særlige radioaktivitet. Der skal være rigelig blyafskærmning til sikker opbevaring og brug af chrom 51 under alle trin samt korrekt skiltning for at indikere, hvor prøver med Chrom 51 opbevares. En Geiger-tæller udstyret med en pandekagesonde er også nødvendig for at tjene i rummet for mulig forurening.
når den er oprettet til korrekt brug af radioaktivitet, tilsættes 100 mikrokurier af krom 51 direkte til målcellesuspensionen. Derefter tilsættes et lille stykke radioaktivt tape til røret for at indikere, at prøven og røret nu er radioaktive. Placer røret i en inkubator på 37 grader celsius med et blyskærm og inkuber i en time, og VIP røret hvert 15.til 20. minut.
mens målcellerne mærker, skal du forberede en enkeltcellesuspension af effektorceller. I dette eksempel blev humane perifere blodmono-nukleare celler eller Pdmc ‘ er isoleret fra helblod ved standarddensitetsgradientcentrifugering til en koncentration på 5 gange 10 til den 6. Overfør denne effektorcellesuspension til et engangsreagensreservoir, og tilsæt derefter 200 mikroliter af denne suspension i hver brønd i række B i en 96-brønds rundbundsplade. Derefter tilsættes 100 mikroliter RPMI til hver brønd i række C gennem g af pladen.
Begynd nu at udføre seriefortyndinger af Pbmc ‘ erne for at have en række effektorcelletal ved først at fjerne 100 mikroliter af cellerne i brøndene i række B og tilføje dette til række C. fortynd derefter effektorcellerne yderligere ved at overføre 100 mikroliter celler fra række C til række D. Fortsæt seriefortyndingen. Når række G er nået, skal du flytte 100 mikroliter fra brøndene for at efterlade et endeligt volumen på 100 mikroliter i hver brønd i den række. Dernæst tilsættes 100 mikroliter vævskulturmedium til brøndene i række A for at tjene som kontrol for spontan frigivelse af chrom 51 Fra målcellerne, da der ikke skal tilføjes effektorceller til denne række. Placer derefter en plade i en inkubator på 37 grader celsius, indtil målcellerne er klar til at blive tilføjet.
efter inkubationsperioden fjernes målcellerne fra inkubatoren og vaskes med 5 ml FBS for at fjerne overskydende krom 51. Placer derefter røret i en udpeget centrifuge og drej ved 1200 o / min i 5 minutter. Fjern den radioaktive FBS-vask i en passende affaldsbeholder, og gentag vasketrinnet ved at resuspendere pelleten i en frisk 5 ml FBS. Anbring røret i en udpeget centrifuge, og drej cellerne igen ved 1200 o / min i 5 minutter. Fjern den anden vask, og kontroller pelleten for inkorporeret radioaktivitet ved hjælp af en Geiger-tæller. Til sidst opblandes pelleten i 10 ml komplet medium og hæld chrom 51 mærket, målcellesuspension i et engangsreagensreservoir. Derefter tilsættes 100 mikroliter af disse mærkede målceller til hver brønd i 96-brøndeffektorcellepladen. Derefter tilsættes 100 mikroliter 1% NP-40 i vand til brøndene i række H for at lyse alle målcellerne denne hver række. Disse brønde vil blive brugt som kontrol til at bestemme de samlede tællinger pr.
når pladen er klargjort, skal du fastgøre låget ved at tilføje et lille stykke tape til hver side af pladen og placere et stykke radioaktivt tape på låget for at indikere, at det indeholder krom 51. Placer derefter pladen i en centrifuge markeret til at håndtere radioaktive prøver. Hvis der kun bruges en eksperimentel plade, skal du tilføje en balanceplade til centrifugen. Indstil centrifugen til 1200 o / min, og bring pladen op i hastighed. Når du er ved hastigheden, skal du stoppe maskinen. Fjern pladen fra centrifugen. Placer derefter pladen i en inkubator på 37 grader celsius med et lille stykke blyafskærmning over pladen for yderligere sikkerhed. Inkuber i 16 timer for at lade målcellerne lyse.
ved slutningen af inkubationsperioden skal du forsigtigt fjerne båndet rundt om kanten af pladen og fjerne låget. Placer derefter høstrammen på pladen, og sørg for at bekræfte, at de små filterskiver er på plads for hver af bomuldspropperne. Tryk nu langsomt og forsigtigt på bomuldspropperne i brøndene. Efter cirka ti sekunder skal du frigøre trykket på bomuldspropperne og derefter overføre bomuldspropperne til rørstrimler. Placer hvert af disse rør i et sekundært FACS-rør. Til sidst skal du indlæse FACS-rørene på en gammatæller og køre prøverne for at kvantificere mængden af krom 51 frigivet i hver tilstand. Registrer forsigtigt den rækkefølge, hvor rørene blev indlæst i tælleren.
her blev ustimulerede Pbmc ‘er føjet til de første 3 baner, og CPG-stimulerede Pmbc’ er blev føjet til baner 4 til 6. Minut blev indtastet i cellerne i et regneark på samme måde som prøverne blev lagt ud i den originale plade, og gennemsnittet af triplicaterne blev beregnet. For eksempel blev cellerne A1, A2 og A3 for den første tilstand gennemsnitligt i celle i3. Når gennemsnittet er bestemt, kan procentdelen af specifik lysis for hver tilstand beregnes ved hjælp af denne formel. For eksempel for at beregne den procentspecifikke lysis for de ustimulerede celler, der havde et forhold på 50 til 1 effektorceller til målceller, blev den spontane CPM, som i dette eksempel er 1164,67, trukket fra den eksperimentelle CPM, 1129. 67. Dette tal kan derefter divideres med forskellen mellem den maksimale CPM og den spontane CPM og derefter ganget med 100 for at give den procentvise specifikke lysis. Dette beregnes derefter for hver betingelse. Disse data kan derefter tegnes for at vise sammenligning af E til T-forholdet med den procentspecifikke lysis for både de ustimulerede Pbmc ‘er og CPG-stimulerede Pbmc’ er. I dette eksempel dræbte effektorceller stimuleret med CPG mere effektivt målceller, da forholdet mellem effektorceller og målceller steg. Denne stigning blev ikke observeret i de ustimulerede Pbmc ‘ er, hvilket indikerer, at CPG-stimulering er nødvendig for den observerede stigning i målcellelyse.