anvendelse af Cobas 4800-systemet til påvisning af højrisiko humant Papillomavirus hos 5650 asymptomatiske kvinder

abstrakt

højrisiko papillomavirus (HR-HPV) test kombineret med cytologi forbedrer påvisning af cervikale læsioner og øger længden af screeningsintervaller. For en befolkningsbaseret HR-HPV-undersøgelse er testautomatisering i stort behov. Cobas 4800 HPV-testsystemet er et fuldautomatisk assay, der samtidig kan detektere HPV16, HPV18 og andre 12 puljede HR-HPV-genotyper. Dette system er blevet anvendt til HR-HPV-screening i en række lande; en sådan anvendelse i en stor befolkning i Kina er imidlertid ikke dokumenteret. I denne undersøgelse anvendte vi Cobas 4800 HPV testsystem til at detektere HR-HPV i cervikale cytologiprøver indsamlet fra i alt 5650 asymptomatiske kvinder fra en region i Sydkina. Vi rapporterede følgende: (1) prævalensen af de 14 genotyper af HR-HPV var 12,96%; (2) for dem med HR-HPV-infektion var 2,25% positive for HPV16, 0,50% for HPV18, 9,15% for samlede 12 HPV-typer og 1,06% for multipel HPV-infektion; og (3) der var ingen signifikant forskel i HR-HPV-prævalensen blandt forskellige aldersgrupper. HPV16 og HPV18 har vist sig at være de dominerende HPV-typer, der findes hos livmoderhalskræftpatienter i nogle regioner i Kina, hvilket indikerer, at et fuldt automatiseret assay som Cobas 4800 HPV-testsystem er særligt værdifuldt til befolkningsbaseret HR-HPV-screening i disse regioner, da dette assay samtidig kan detektere HPV16 og HPV18.

1. Introduktion

humant papillomavirus (HPV) er en dobbeltstrenget DNA-virus af Papillomaviridae-familien . Der er mere end 200 genotyper af HPV, der er blevet identificeret, blandt hvilke 15 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, og 82) er stærkt forbundet med livmoderhalskræft . Livmoderhalskræft er den fjerde mest almindelige kræft hos kvinder over hele verden og den sjette mest almindelige kræft hos kvinder i Kina . For at reducere byrden ved livmoderhalskræft er tidlig identifikation af cervikale læsioner, der sandsynligvis udvikler sig til invasiv kræft, af største vigtighed. Cervikal cytologi spiller en vigtig rolle i forebyggelsen af livmoderhalskræft . Tilføjelsen af HPV-test til cytologi resulterer i en øget påvisning af cervikale læsioner af høj kvalitet, og det anbefales derfor, at screening af HPV med høj risiko (HR-HPV) inkorporeres i cytologi for at forbedre sygdomsdetektering og øge længden af screeningsintervaller .

til dato er der rapporteret om forskellige metoder til HPV-genotypebestemmelse og detektion . Til befolkningsbaseret screening er testautomatisering især nyttig, da automatisering har evnen til at behandle et stort antal prøver på kort tid og reducere menneskelige fejl, der kan opstå i manuelle operationer. Cobas 4800 HPV testsystem (Roche Molecular Systems Inc. Fuldt automatiseret, er designet til samtidig at detektere i alt 14 HR-HPV-typer: HPV16 individuelt, HPV18 individuelt og 12 samlede HR-HPV-genotyper (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68). Dette system er godkendt af US Food and Drug Administration til HR-HPV screening. Cobas 4800 HPV-testsystemet består af 2 dele, dvs. 480 Instrument, der bruges til automatisering af nukleinsyreoprensning og PCR-prøvepipettering og en Cobas 480 analysator, der er til automatisk PCR-amplifikation i realtid og efterfølgende typespecifik hybridisering. Selvom brugen af Cobas 4800-systemet til HR-HPV-test er rapporteret i en række lande , er en sådan anvendelse i en stor befolkning i Kina ikke dokumenteret. I denne undersøgelse anvendte vi Cobas 4800 HPV testsystem til at detektere HR-HPV i cervikale cytologiprøver indsamlet fra i alt 5650 asymptomatiske kvinder.

2. Metoder

denne undersøgelse blev godkendt af Udvalget for medicinsk forskning i Hongshan Hospital for Traditionel kinesisk medicin. Informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

2.1. Cervikal prøveindsamling

asymptomatiske kvinder i alderen 20-65 år blev tilmeldt fra januar 2018 til December 2018 til denne undersøgelse med testomkostningerne dækket af forsøgspersoner eller deres arbejdsgivere eller i kombination. Inklusionskriterierne inkluderer at være 20 år eller ældre, ikke være gravid, have intakt livmoder, være seksuelt aktiv eller have historie med seksuel aktivitet. Alle forsøgspersoner blev informeret om ikke at bruge vaginal medicin, vaginale svangerskabsforebyggende midler eller smøremidler i 48 timer før cervikal prøveudtagning. Den endocervikale prøveudtagningsdel af enheden blev indsat i den endocervikale kanal for at tillade de laterale børster at komme fuldt ud i kontakt med ektocerviksen, og enheden blev derefter drejet to fulde drejninger med uret. Efter tilbagetrækning blev enheden med de høstede celler straks indsat i et hætteglas indeholdende PreservCyt-opløsning (Hologic Inc. Bedford, MA, USA) og hvirvlede kraftigt. Prøver blev anvendt til HPV-DNA-detektion som beskrevet nedenfor.

2.2. HR-HPV-detektion ved hjælp af Cobas 4800 HPV-testsystemet

Lysis-Buffer, vaskebuffer, Elueringsbuffer, HPV-Positive og Negative Kontrolsæt og alle andre reagenser blev købt hos Roche Molecular Systems Inc. Hver prøve havde en intern kontrol, Kurt-globin, for at overvåge celletilstrækkelighed, og hvert løb omfattede et sæt HPV-Positive og Negative kontroller. DNA-ekstraktion og rensning blev udført med Cobas 480-instrumentet i henhold til producentens anvisninger. Kort sagt blev PreservCyt-Opløsningsprøverne virvlet og anbragt på prøvebæreren, og reagenserne, f.eks. lysisbuffer, vaskebuffer og Elueringsbuffer, blev indlæst i respektive reagensreservoirbærere. Efter prøve-og reagensbelastning blev DNA-forberedelse afsluttet automatisk, og endelige DNA-produkter blev opsamlet i en mikrobølgeplade. Derefter blev mikrobølgepladen indeholdende DNA manuelt forseglet og indlæst på Cobas 480 analysatoren, og amplifikationen og hybridiseringen blev afsluttet automatisk.

2.3. Statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 13.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Det blev brugt til at vurdere kategoriske variabler. Alle statistiske tests var 2-sidede, og værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.

3. Resultater

i alt 5650 asymptomatiske kvinder i alderen 20-65 år med en gennemsnitlig alder på år opfyldte studiekravet og blev inkluderet i denne undersøgelse. Af disse deltagere blev 732 (12,96%) påvist som HR-HPV-positive, inklusive 127 (2,25%) med HPV16-infektion, 28 (0,50%) med HPV18, 517 (9,15%) med samlede 12 HPV-typer og 60 (1,06%) med multiple HPV-infektion (HPV16 blandet med HPV18, HPV16 blandet med 12 samlede typer, HPV18 blandet med 12 samlede typer eller HPV16 blandet med hpv18 og 12 samlede typer) (tabel 1).

ifølge alderen blev deltagerne opdelt i 4 grupper: 20-30, 31-40, 41-50 og >51 år. Som vist i tabel 2 havde gruppen på 31-40 år den højeste HR-HPV-infektionsrate på 15,32% efterfulgt af grupperne >50 år, 41-50 år og 20-30 år, skønt der ikke blev observeret nogen statistisk signifikans blandt infektionsraterne for disse grupper.

4. Diskussion

i denne undersøgelse brugte vi Cobas 4800-systemet til at detektere HR-HPV hos 5650 asymptomatiske kvinder og fandt følgende: (1) forekomsten af de 14 genotyper af HR-HPV var 12,96%; (2) af de 732 HR-HPV-positive kvinder var 2,25% positive for HPV16, 0,50% for HPV18, 9,15% for samlede 12 HPV-typer og 1,06% for flere HPV-infektion; og (3) der var ingen signifikant forskel i HR-HPV-prævalensen blandt forskellige aldersgrupper.

begge HPV-test i realtid med høj risiko fra Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, IL, USA) og Cobas 4800 HPV-testsystemet er klinisk validerede, fuldautomatiske PCR-baserede analyser til påvisning af HR-HPV . En fordel ved disse 2 analyser er, at de samtidig kan opdage og skelne HPV16 og HPV18, hvilket er vigtigt for screening af livmoderhalskræft, da HPV16 og HPV18 tegner sig for cirka 70% af livmoderhalskræft globalt . Få undersøgelser har sammenlignet disse 2 analyser til påvisning af HR-HPV i kliniske prøver. Park et al. testede 365 cervikale vatpindeprøver og rapporterede, at HPV-testen i realtid med høj risiko præsenterede en følsomhed på 78,3% med en specificitet på 99,2%, mens følsomheden og specificiteten af Cobas 4800-systemet var henholdsvis 91,7% og 97,0%. Cusick et al. screenede 6000 kvinder og afslørede, at 16,0% blev påvist at være HR-HPV-positive af Cobas 4800-systemet, mens 13,4% blev påvist at være HR-HPV-positive ved realtime high Risk HPV-Test . Disse data indikerer, at Cobas 4800-systemet har større detektionsfølsomhed.

flere klinisk validerede molekylære systemer til påvisning af HR-HPV DNA er blevet inkluderet af Verdenssundhedsorganisationen i 2016 i manualen integrering af HPV-test i screeningsprogrammer for livmoderhalskræft-en Manual til programledere (https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2016/manual-VPH-English—FINAL-version.pdf). Disse tests består af hybridiseringsbaserede analyser, dvs. Hybrid Capture 2-teknikken og CareHPV-testen og PCR-baserede analyser, f. eks., Cobas HPV-testen, Abbott realtime high Risk HPV-testen, Cervista HPV HR-testen og BD HPV-analysen. Alle PCR-baserede analyser kræver DNA-isolering, mens hybridiseringsbaserede analyser ikke gør det. Af alle metoderne tager Cervista HPV HR-testen 6-7 timer, og Abbott realtime high Risk HPV-analysen tager 6-8 timer at køre, hvilket muligvis ikke opfylder målet om “se og behandle” samme dag. I modsætning hertil kræver alle hvilemetoder inklusive Cobas 4800-systemet imidlertid en maksimal driftstid på cirka 5 timer, der er velegnet til patienter til at gennemføre “se og behandling” i et besøg.

globalt varierer HR-HPV-prævalensen fra kontinent til kontinent . I Kina er der anvendt forskellige metoder til undersøgelse af HR-HPV-prævalens . Et al. anvendte Hybrid Capture 2-analysen (Chiagen, Hilden, Tyskland) til påvisning af HR-HPV af 13 poolede typer (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, og 68) i alt 4215 kvinder i alderen 17-54 år fra 5 forskellige geografiske områder i Kina og opdagede, at HR-HPV-prævalensen var 12,4% . Ved hjælp af samme metode som vu et al. , Hao et al. fandt, at 15.2% af 1274 kvinder fra en region i Nordkina var positive for HR-HPV . Chen et al. ansat et HPV-Genotypesæt (Yaneng Biotechnology Limited Corp., Kina) til i alt 961.029 HPV-test for kvinder i alderen 16 til 83 år fra det sydøstlige Kina og afslørede en HR-HPV-infektionsrate på 16,61% . Jing et al. anvendt en massespektrometrisk analyse til HPV-DNA-test hos 78.355 kvinder i alderen 18 Til 75 år fra Sydkina og rapporterede en <7,3% HR-HPV prævalensrate . Disse undersøgelser viser en HR-HPV-infektionsrate på cirka 10-15% hos kinesiske kvinder, hvilket er i overensstemmelse med vores fund. Den metode, vi brugte i denne undersøgelse, er imidlertid enklere og mindre besværlig sammenlignet med dem, der blev brugt i tidligere undersøgelser .

to undersøgelser med den største stikprøvestørrelse udført i Kina har sammenlignet HR-HPV-prævalensrater blandt aldersgrupper. Et al. retrospektivt analyserede 671.163 HPV-test udført ved hjælp af Hybrid Capture 2-metoden fra 2007 til 2014 og demonstrerede den højeste HR-HPV-prævalens på 36.9% i aldersgruppen < 20 år, mens HR-HPV-positive satser for aldersgrupperne 20-30, 30-40 og 40-50 år var henholdsvis 24,4%, 19,7% og 19,9%. HR-HPV-test med den største prøvestørrelse (961.029 prøver) udført af Chen et al. viser igen den højeste prævalensrate for HR-HPV i aldersgruppen < 20 år (22,3%), mens prævalensen for aldersgrupperne 20-30, 30-40 og 40-50 år er henholdsvis 16,8%, 15,2% og 15,9%. Disse undersøgelser afslører en lidt højere prævalens i gruppen på 20-30 år end i grupperne på 30-40 og 40-50 år, hvilket er i modsætning til vores resultater, da vi observerede den laveste HR-HPV-prævalens i gruppen på 20-30 år. Denne uoverensstemmelse kan opstå på grund af følgende faktorer: (1) yngre kvinder har i dag mere adgang til sundhedsuddannelsesprogrammer, især online-programmer, der bruger elektroniske enheder, og (2) yngre kvinder er mere ivrige efter at lære og acceptere ny viden om sanitet og seksuel sundhed.

HPV16 er den mest almindelige type HR-HPV, der findes i cervikale prøver af kvinder fra nord (Beijing og Henan, Shanksi og Shinjiang provinser), sydøst (Shanghai og Jejiang provinsen) og Sydkina (Guangdong provinsen) regioner, med en positiv sats, der spænder fra 1,5 til 3,6% , hvilket er på linje med en 2,25% HPV16 infektion sats observeret i vores undersøgelse emner, der er fra Sydkina. HPV16 er ansvarlig for cirka 50% af livmoderhalskræft globalt . Mens oplysningerne om HR-HPV-genotypefordeling hos kinesiske livmoderhalskræftpatienter stadig er begrænsede, li et al. rapporterede, at 1818 ud af 2309 livmoderhalskræftpatienter (78,7%) fra Vestkina var positive for HPV16, og cirka 90% af disse patienter var positive for HPV16 og HPV18 . En infektionsrate på 53,2% for HPV16 og HPV18 blev også vist hos 326 livmoderhalskræftpatienter fra Fujian-provinsen i det sydøstlige Kina . Disse data indikerer, at HPV16 og HPV18 er de dominerende HPV-typer, der findes hos livmoderhalskræftpatienter i disse regioner. Et fuldt automatiseret assay som Cobas 4800 HPV testsystem, der samtidig kan opdage og differentiere HPV16 og HPV18, vil være særligt værdifuldt for befolkningsbaseret HR-HPV screening i regioner, der har en HPV16 og HPV18 infektionsdominans.

datatilgængelighed

de data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter efter anmodning.

interessekonflikter

forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

forfatterens bidrag

SV, HH, KP og Ls rekrutterede deltagerne, indsamlede prøver og udførte test. J. og J. skrev artiklen. FM gennemgik litteraturen og udførte statistisk analyse. JS designede undersøgelsen, analyserede dataene og godkendte endelig manuskriptet.