protilátky
Králík IgG (Sigma) konjugovaný s Dynabeads byl použit proti kmenům označeným Tapem, ve kterých byl cíl TAP-tag obsahující Protein a. Protilátka Millipore 07-729 byla použita proti vzorkům K562 zaměřeným na CTCF.
čištění Tn5
vlastní konstrukt TN5 E54K E110K P242A L372P14 ve vektoru pET-45b( + ) byl nařízen (GenScript), aby exprimoval hyperaktivní Tn5 pomocí N-terminálu His6-tag. Plazmid je dostupný na adrese Addgene (Addgene ID: 112112). BL21 (DE3) byly transformovány příslušné buňky E.coli (New England Biolabs) a jedna kolonie byla pěstována při 37 °C na OD600 0,4 v 500 ml LB + 50 µg/ml ampicilinu + 30 µg/ml chloramfenikolu. Buňky byly přeneseny do inkubátoru o teplotě 25 °C a indukovány 0,5 mM isopropyl-β-d-galaktopyranosidem po dobu 4 h. buňky byly odebrány centrifugací, jednou promyty St pufrem a buněčná peleta byla bleskově zmrazena v kapalném dusíku.
Tn5 byl čištěn, jak bylo dříve popsáno10, s několika modifikacemi. Krátce byly buňky resuspendovány v 10 objemech (ml/g) pufru TEGX100 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,1% Triton-X 100) obsahujících CPI a 100 µM fenylmethylsulfonylfluorid a lyzovány inkubací s lysozymem (Sigma; 1 mg / 1 g buněčné pelety) při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Lyzát byl centrifugován při 20 000 × g po dobu 20 minut při 4 °C a supernatant byl vysrážen 0,25% polyethyleniminem (Sigma)a centrifugován při 10 000 × g po dobu 15 minut. Supernatant byl potom vysrážen 47% saturací síranu amonného (0.28 g / ml) po dobu 30 minut inkubace a poté se odstředí při 20 000 × g po dobu 15 minut.
pak byla peleta resuspendována v 50 ml Náložového pufru afinity k niklu (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glycerol) a naplněna na kolonu HisTrap HP (GE Healthcare; 5 ml) při 1,5 ml/min vyrovnané se stejným pufrem. Kolona byla postupně promyta promývacím pufrem I (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidazol, 20% glycerol), promývacím pufrem II (50 mM fosforečnan draselný, pH 7.4 500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glycerol) a poté se TN5 eluuje Elučním pufrem afinity niklu (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,4, 500 mM KCl, 500 mM imidazol, 20% glycerol) při 2 ml/min. Eluát byl zředěn na 300 mM KCl ředicím pufrem (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,4, 20% glycerol) a konečný objem upraven na 50 ml pomocí Tegx300 pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,1% Triton – X 100).
poté byl vzorek vložen do kolony hp HiTrap Heparin (GE Healthcare; 1 ml), která byla vyrovnána s TEGX300 při 1 ml/min. Po promytí 5 sloupcovými objemy pufru byl spuštěn 10-ml lineární (300 mM až 1,2 M) gradient NaCl, aby se elutoval. Tn5 eluovaný z kolony při přibližně 600 mM NaCl. Frakce obsahující hlavní eluční pík byly kombinovány (3,5 ml) a dialyzovány přes noc proti pufru TEGX300 obsahujícímu 30% glycerolu a poté skladovány při -80 °C.
kvasnicový přípravek chromatinu
TAP-tagged Saccharomyces cerevisiae kmeny (otevřené biosystémy) byly pěstovány v 500 ml kvasnicového peptonového dextrózového média na OD600 = 0,8 při 25 °C. Buňky byly zesítěny formaldehydem v konečné koncentraci 1% po dobu 15 minut při pokojové teplotě a kaleny konečnou koncentrací 125 mM glycinu po dobu 5 minut. Buňky byly odebrány centrifugací a promyty v 1 ml St pufru (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) při 4 °C a rozděleny na dvě alikvoty. Buňky byly znovu peletovány, supernatant byl odstraněn a peleta byla bleskově zmrazena.
250 ml kultivační alikvot byl lyzován v 750 µl fa Lyzačního pufru (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% deoxycholátu sodného a CPI) a 1 ml objemu 0,5 mm zirkonia / oxidu křemičitého perličkami bitím v Mini-Beadbeater-96 stroji (Biospec) po dobu tří cyklů 3 min on/5 min off cyklů (vzorky byly uchovávány na ledu během off cyklu). Lyzát byl převeden do nové zkumavky a mikrocentrifugován při maximální rychlosti po dobu 3 minut při 4 °C, aby se chromatin peletoval. Supernatant byl zlikvidován a peleta byla resuspendována v 750 µl fa Lýzního pufru doplněného 0,1% SDS a přenesena do 15 ml polystyrenové kónické zkumavky. Vzorek byl poté sonikován v Bioruptoru (Diagenode) po dobu 15 cyklů s intervaly zapnutí/vypnutí 30 s, aby se získaly fragmenty DNA o velikosti 100 až 500 bp. Jeden test ChIP-exo zpracoval ekvivalent 50 ml buněčné kultury (~6 × 108 buněk). To představuje spíše vhodnou částku než minimální potřebnou částku.
přípravek k562 chromatinu
lidské chronické myeloidní leukemické buňky (K562, ATCC) byly udržovány mezi 1 × 105 a 1 × 106 buňkami/ml v médiu DMEM doplněném 10% fetálním bovinním sérem při 37 °C s 5% CO2. Buňky byly promyty PBS (8 mM NA2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl a 2,7 mM KCl), poté zesítěny formaldehydem v konečné koncentraci 1% po dobu 10 minut při pokojové teplotě a ochlazeny konečnou koncentrací 125 mM glycinu po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn a buňky byly resuspendovány v 1 ml PBS, aby se promyly. Buňky byly alikvotovány tak, aby obsahovaly 100 milionů buněk, odstředěny, supernatant byl odstraněn a peleta byla bleskově zmrazena.
100 milionů buněčných alikvotů (pro použití ve více čipech) bylo lyzováno v 500 µl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40 a kompletní inhibitor proteázy (CPI, Roche)) inkubací na ledu po dobu 10 minut. Lyzát byl mikrocentrifugován při 2500 ot / min po dobu 5 minut při 4 °C. supernatant byl odstraněn, peleta resuspendována v 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS a CPI) a inkubována na ledu po dobu 10 minut, aby se jádra lyzovala. Vzorek byl zředěn 600 µl imunoprecipitačního ředicího pufru (IP ředicí pufr: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 a CPI) na konečnou koncentraci (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0.2% SDS a CPI), a sonikován s Bioruptor (Diagenode) po dobu 10 cyklů s 30 S on/off intervaly pro získání fragmentů DNA 100 až 500 bp ve velikosti.
příprava myší tkáně
16 týdnů starý dospělý samec myší mozkové, plicní, jaterní a ledvinové tkáně byly velkoryse poskytnuty Dr. Yanming Wang myší tkáně byly zpracovány v dávce 100 mg a chromatin byl generován, jak bylo dříve popsáno21 s menšími modifikacemi. Stručně řečeno, 100 mg myší tkáně bylo rozdrceno na kousky na ledu, fixováno 1% formaldehydem po dobu 10 minut a poté ochlazeno konečnou koncentrací 125 mM glycinu po dobu 5 minut. Buňky byly roztočeny, promyty PBS a poté resuspendovány v 1 mL studeného pufru na lýzu Farnhamových buněk (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 a CPI). Buňky byly poté inkubovány na rototorku po dobu 20 minut při 4 C. izolovaná jádra byla izolována spunem dolů a resuspendována v nukleárním lyzačním pufru RIPA (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoxycholátu, 0,5% SDS a CPI). Jádra byla poté sonikována Bioruptorem (Diagenodou) po dobu 10 cyklů s 30 s intervaly zapnutí/vypnutí, aby se vytvořila DNA v rozsahu velikosti 100-500 bp. Počty jaterních buněk byly odhadnuty, jak bylo dříve popsáno22, za použití konverzního faktoru 1 mg tkáně mokré hmotnosti se rovná ~250 000 buněk.
chromatinová imunoprecipitace
50 ml kultivační ekvivalent kvasinek nebo 10 milionů buněčného ekvivalentu k562 chromatinu byl zředěn na 200 µl ředicím pufrem IP a inkubován přes noc při 4 °C s příslušnou protilátkou. Do vzorků kvasinek byl přidán objem 10 µl lože IgG-Dynabeadů; a do vzorků K562 byly přidány 3 µg anti-CTCF protilátky s 10 µl suspenzního ekvivalentu proteinu a Mag Sepharose (GE Healthcare).
ChIP-exo 1.1
ChIP-exo 1.1 byl proveden tak, jak bylo dříve popsáno7, 8, 23. Stručně řečeno, následující enzymatické kroky byly provedeny s imunoprecipitovaným chromatinem stále na pryskyřici s více promýváním solí mezi každým krokem: T4 DNA polymeráza end leštění, T4 polynukleotid kináza, Klenow fragment a-tailing, T4 dna ligázou zprostředkované Read_2 Adapter ligation, phi29 DNA polymeráza fill-in, druhá T4 polynukleotid kináza, lambda exonukleázy trávení a RecJf exonukleázy trávení. Po nočním zpětném zesítění a ošetření Proteinázou K byly v roztoku provedeny následující kroky: rozšíření primeru phi29, druhý klenowův fragment a-tailing, ligace adaptéru Read_1 zprostředkovaná T4 dna ligázou a PCR.
ChIP-exo 3.0 a 3.1 (verze založená na tagmentaci)
po imunoprecipitaci byly na pryskyřici provedeny následující kroky. Pro sestavení Transposázy byl Tn5 inkubován v 10 × Transposázové směsi obsahující následující složky a inkubován po dobu 30 minut při pokojové teplotě: 12,5 µM Tn5, 50% glycerol a 7,5 µM adaptér (NexA2 / ME comp). Viz doplňková Tabulka 1 pro oligonukleotidové sekvence použité v této studii.
čipový materiál na pryskyřici byl promyt postupně fa Lýzním pufrem, NaCl pufrem (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% deoxycholát sodný), LiCl pufr (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% deoxycholát sodný) a 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C.
tagmentační reakce (30 µl) obsahující: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% dimethylformamid a 1 × Tagmentační směs od kroku 1 (konečná koncentrace: 1,25 µM Tn5, 5% glycerol, 750 nm adaptér) byl inkubován po dobu 30 minut při 37 °C. po inkubaci byla pryskyřice dvakrát promyta guanidin-hydrochloridovým pufrem (50 mm Tris-HCL, pH 7,5, 500 mm guanidin-hydrochlorid, 2 mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% deoxycholátu sodného) po dobu 5 minut při 37 °C, poté jednou s LiCl pufrem a 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C.
fill-in reakce (30 µl) obsahující: 10 u phi29 polymerázu (NEB), 1 × phi29 reakční pufr (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA a 165 µM dNTPs byla inkubována po dobu 20 minut při 30 °C; poté promyta 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C. kinázová reakce (30 µl) obsahující: 10 u T4 PNK (neb), 1 × T4 dna ligázový pufr (neb) a 2 × BSA byla inkubována po dobu 15 minut při 37 °C; poté se promyje 10 mm Tris-HCL, pH 8,0 při 4 °C. trávení λ exonukleázy (100 µl) obsahující: 20 U λ exonukleázy (NEB), 1 × λ exonukleázový reakční pufr (NEB), 0,1% Triton-X 100 a 5% DMSO byl inkubován po dobu 30 minut při 37 °C; poté promyt 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C.trávení Exonukleázy RecJf (100 µl) obsahující: 75 U RecJf exonukleázy (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0,1% Triton-X 100 a 5% DMSO bylo inkubováno po dobu 30 minut při 37 °C; pak se promyje 10 mm Tris-HCL, pH 8,0 při 4 °C.
DNA byla Eluována z pryskyřice a bylo provedeno reverzní zesítění a ošetření proteinázou k (40 µl) obsahující: 30 µg proteinázy k, 25 mm tris-HCL, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mm NaCl a 0,5% SDS inkubovány po dobu 16 hodin při 65 °C. supernatant byl poté převeden do nové zkumavky a čištěn magnetickými kuličkami Agencourt AMPure (Beckman Coulter) podle pokynů výrobce a za použití 1,8 × objemu suspenze AMPure přidané k objemu DNA (72 µl).Vzorek byl eluován z ampurových kuliček v 10 µl vody a v roztoku byly provedeny následující enzymatické kroky.
ligace adaptéru (verze 3.0): pro reakci na rozšíření primeru (celkový reakční objem 20 µl); k resuspendovanému vzorku byl přidán 1 × phi29 reakční pufr, 2 × BSA, 100 µM dNTPs a 0,5 µM me sekvenční oligonukleotid (celkem 9 µl) a inkubován po dobu 5 minut při 95 °C, poté 10 minut při 45 °C, aby se umožnil oligo čas žíhat. Vzorek byl posunut na 30 °C před přidáním polymerázy 10 u phi29 (1 µl) a inkubací po dobu 20 minut při 30 °C; poté po dobu 10 minut při 65 °C inaktivovat a posunut na 37 °C.
pro a-tailingovou reakci (celkový reakční objem 30 µl); k reakci rozšíření primeru bylo přidáno 10 U Klenowova fragmentu, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (celkem 10 µl) a inkubováno po dobu 30 minut při 37 °C, poté po dobu 20 minut při 75 °C, aby se inaktivovalo, a posunuto na 25 °C. pro druhou ligační reakci adaptéru (celkový reakční objem 40 µl); K a-tailingové reakci bylo přidáno 2 000 U T4 dna ligázy (enzymatika), 1 × NEBNext rychlý ligační pufr (NEB), 375 nM adaptér (exa1-58/13) a inkubována po dobu 1 hodiny při 25 °C.
dlaha ligace (verze 3.1): pro ligaci adaptéru (40 µl); k resuspendované DNA bylo přidáno 1 200 U T4 DNA ligázy, 1 × T4 dna Ligázový pufr, 375 nM adaptér (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) a inkubován po dobu 1 hodiny při 25 °C.
obě verze 3.0 a 3.1: ligační reakce byla poté purifikována ampurovými kuličkami a resuspendována v 15 µl vody. Vzorek byl poté amplifikován pomocí PCR. Pro PCR amplifikaci (celkový reakční objem 40 µl); k resuspendované DNA byla přidána 2 U Phusion Hot Start polymeráza (Thermo scientific), 1 × Phusion HF pufr (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM každý primer (P1.3 a NexA2-iNN) a amplifikován pro 18 cyklů (20 s při 98 °C denatura, 1 min při 52 °C žíhání a 1 min při 72 °C prodloužení). Čtvrtina reakce byla amplifikována dalších šest cyklů (celkem 24) a přítomnost knihoven byla stanovena elektroforézou na 2% agarózovém gelu.
výběr velikosti: produkty 200-500 bp PCR byly gelově čištěny z 2% agarózového gelu pomocí soupravy pro extrakci gelu QIAquick (Qiagen).
ChIP-exo 4.0 a 4.1 (jednovláknové DNA ligační verze)
po imunoprecipitaci byly na pryskyřici provedeny následující kroky. Čipový materiál na pryskyřici byl promyt postupně fa Lýzním pufrem, NaCl pufrem, LiCl pufrem a 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C.konečná opravná reakce (50 µl) obsahující: 7,5 U T4 DNA polymerázy (NEB), 2,5 u DNA polymerázy I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 dna Ligázový pufr a 390 µM dNTPs byla inkubována po dobu 30 minut při 12 °C; poté se promyje 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C. C. trávení λ exonukleázy (100 µl)obsahující: 20 U λ Exonukleázy, 1 × λ exonukleázový reakční pufr, 0,1% Triton-X 100 a 5% DMSO bylo inkubováno po dobu 30 minut při 37 °C; pak se promyje 10 mm Tris-HCL, pH 8.0 při 4 °C. trávení Exonukleázy RecJf (100 µl)obsahující: 75 U RecJf exonukleázy, 2 × NEBuffer 2, 0,1% Triton-X 100 a 5% DMSO swas inkubované po dobu 30 minut při 37 °C; poté se promyje 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C.
první ligace adaptéru: ligace ssDNA (verze 4.0, 40 µl): pro ligaci adaptérů 1200 u T4 dna ligázy, 1 × T4 DNA ligázy ligázový pufr a 375 Nm jednovláknový adaptér (exa1-58-N5) byl inkubován po dobu 1 hodiny při 25 °C; poté se promyje 10 mm Tris-HCL, pH 8,0 při 4 °C.
ligace dlahy (verze 4.1, 40 µl): 1200 U T4 DNA ligázy, 1 × T4 dna Ligázový pufr a 375 nM adaptér (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) se inkubuje po dobu 1 hodiny při 25 °C; poté se promyje 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C.
obě verze 4.0 a 4.1: DNA se eluuje z pryskyřice a bylo provedeno reverzní zesítění a ošetření Proteinázou K (40 µl) obsahující: 30 µg proteinázy K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 mm,, 2 mm EDTA, 200 mm NaCl a 0,5% SDS inkubovaných po dobu 16 h při 65 °C.
supernatant byl poté převeden do nové zkumavky a čištěn magnetickými kuličkami Agencourt AMPure (Beckman Coulter) podle pokynů výrobce (1,8 × objem). Vzorek byl eluován z ampurových kuliček ve 20 µl vody a v roztoku byly provedeny následující enzymatické kroky.
druhá ligace adaptéru: ssDNA ligace (verze 4.0, celkový reakční objem 40 µl): k resuspendované DNA bylo přidáno 1200 U T4 DNA ligázy, 1 × T4 dna Ligázový pufr, 375 nM adaptér (ExA2. 1-N5 / ExA2. 1-20) a byl inkubován po dobu 1 hodiny při 25 °C.
ligace adaptéru dlahy (verze 4.1, celkový reakční objem 40 µl): k resuspendované DNA bylo přidáno 1200 U T4 DNA ligázy, 1 × T4 dna Ligázový pufr, 375 nM adaptér (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) a byl inkubován po dobu 1 hodiny při 25 °C.
obě verze 4.0 a 4.1: ligační reakce byla poté purifikována ampurovými kuličkami (1,8 × objem) a resuspendována v 15 µl vody. Vzorek byl poté amplifikován pomocí PCR. Pro PCR amplifikaci (celkový reakční objem 40 µl); k resuspendované DNA byla přidána 2 U Phusion Hot Start polymeráza (Thermo scientific), 1 × Phusion HF pufr (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM každý primer (P1. 3 a NexA2-iNN) a amplifikována po dobu 18 cyklů (20 s při 98 °C denatura, 1 min při 52 °C žíhání, 1 min při 72 °C prodloužení). Čtvrtina reakce byla amplifikována dalších šest cyklů (celkem 24) a přítomnost knihoven byla stanovena elektroforézou na 2% agarózovém gelu. Výběr velikosti: produkty 200 až 500 bp PCR byly gelově čištěny z 2% agarózového gelu pomocí soupravy pro extrakci gelu QIAquick (Qiagen).
Poznámka: ChIP-exo 4.0/4.1 obsahuje univerzální adaptér Read_2, s čárovým kódem přidaným později během PCR s dlouhými primery. Kdykoli byly v konstrukci knihovny použity dlouhé PCR primery, které zahrnovaly trávení exonukleázy lambda, knihovny trpěly nízkým výtěžkem a vysokými dimery adaptéru. Nyní používáme pouze celovečerní adaptéry a PCR primery s minimální délkou.
ChIP-exo 5.0
po imunoprecipitaci byly na pryskyřici provedeny následující kroky. Třískový materiál na pryskyřici byl promyt postupně fa Lýzním pufrem, NaCl pufrem, LiCl pufrem a 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C. Pro a-tailingovou reakci (50 µl) obsahující: 15 u Klenow Fragment,- exo (NEB), 1 × NEBuffer 2 a 100 µM dATP byl inkubován po dobu 30 minut při 37 °C; poté promyt 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C. první ligační a kinázové reakce adaptéru (45 µl) obsahující: 1200 u T4 dna ligáza, 10 u T4 PNK, 1 × Nebnext rychlý ligační pufr a 375 Nm adaptér (Exa2_inn / exa2b) byl inkubován po dobu 1 hodiny při 25 °C; pak se promyje 10 mm Tris-HCL, pH 8,0 při 4 °C. Fill-in reakce (40 µl) obsahující: 10 u phi29 polymerázy, 1 × phi29 reakčního pufru, 2 × BSA a 180 µM dNTPs byla inkubována po dobu 20 minut při 30 °C; poté se promyje 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 při 4 °C. trávení λ exonukleázy (50 µl) obsahující: 10 U λ exonukleázy, 1 × λ exonukleázový reakční pufr, 0,1% Triton-X 100 a 5% DMSO bylo inkubováno po dobu 30 minut při 37 °C; pak promyje se 10 mm Tris-HCL, pH 8,0 při 4 °C.
DNA byla eluována z pryskyřice a bylo provedeno reverzní zesítění a ošetření proteinázou k (40 µl) obsahující: 30 µg proteinázy K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl a 0,5% SDS inkubováno po dobu 16 hodin při 65 °C. supernatant byl poté přenesen do nové zkumavky a čištěn magnetickými kuličkami Agencourt AMPure (Beckman Coulter) podle pokynů výrobce (1,8 × objem).Vzorek byl eluován z ampurových kuliček ve 20 µl vody a v roztoku byly provedeny následující enzymatické kroky. Pro druhou ligaci adaptéru (celkový reakční objem 40 µl): k resuspendované DNA bylo přidáno 1200 U T4 dna ligázy, 1 × T4 dna Ligázový pufr, 375 nM adaptér (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) a byl inkubován po dobu 1 hodiny při 25 °C.ligační reakce byla poté purifikována Ampurovými kuličkami (1,8 × objem) a resuspendována v 15 µl vody.
vzorek byl poté amplifikován pomocí PCR. Pro PCR amplifikaci (celkový reakční objem 40 µl); k resuspendované DNA byla přidána 2 U Phusion Hot Start polymeráza (Thermo scientific), 1 × Phusion HF pufr (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM každý primer (P1.3 a P2.1) a zesílen pro 18 cyklů (20 s při 98 °C denatura, 1 min při 52 °C žíhání, 1 min při 72 °C prodloužení). Čtvrtina reakce byla amplifikována dalších šest cyklů (celkem 24) a přítomnost knihoven byla stanovena elektroforézou na 2% agarózovém gelu. Výběr velikosti: produkty 200 až 500 bp PCR byly gelově čištěny z 2% agarózového gelu pomocí soupravy pro extrakci gelu QIAquick (Qiagen).
Poznámka: zjistili jsme, že použití jiné metody než čištění gelu v této fázi vede k nepřijatelně vysoké úrovni adaptérových dimerů v konečném vzorku. Čištění gelu může účinně oddělit dimer adaptéru (fragment 150 bp) a menší fragmenty knihovny ChIP-exo (fragment 200 bp = adaptéry 150 bp + vložka 50 bp).
sekvenování DNA
vysoce výkonné sekvenování DNA bylo provedeno s NextSeq 500 v párovém režimu, který produkoval čtení 2 × 40 bp. Sekvenční čtení bylo následně zarovnáno s genomy kvasinek (sacCer3)a lidí (hg19) pomocí bwa-mem (v0.7.9 a)24. Zarovnané čtení byly filtrovány, aby se odstranily nejedinečné zarovnání a duplikáty PCR. PCR duplikáty byly definovány jako sekvenční čtení s identickými sekvencemi Read_1 a Read_2.
dostupnost dat
všechny sekvenční soubory a špičkové soubory z této studie jsou k dispozici na NCBI genové expresi Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod přístupovými čísly GSE110681 a GSE114606. Souřadnicové soubory, parametry skriptu a vlastní kód používaný ke generování čísel pro tento článek lze stáhnout z: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.
všechny ostatní údaje jsou k dispozici od autorů na přiměřenou žádost.