v tomto videu budete sledovat, jak provést test uvolňování chromu a určit cytotoxický potenciál efektorových buněk.
imunitní buňky jsou zodpovědné za identifikaci a odstranění potenciálně škodlivých buněk, jako je rakovina nebo buňky infikované virem, z těla, což je nedílnou součástí imunitní odpovědi. Několik imunitních buněk, jako jsou T-buňky a NK buňky, má vlastnost známou jako cytotoxický potenciál, což je schopnost identifikovat cílové buňky a vylučovat proteiny, které indukují degradaci proteinů, lýzu a smrt těchto cílových buněk. Kvantifikace cytotoxického potenciálu je rozhodující pro měření aktivace a účinnosti imunitních buněk a pro tento účel se běžně používá test uvolňování Chromu.
tato metoda umožňuje uživatelům porovnat cytoxicitu indukovanou specifickými typy imunitních buněk za různých podmínek, což je cenné pro studium imunoterapie rakoviny a onemocnění souvisejících s imunitou. Za prvé, cílové buňky, jako rakovinné buňky, jsou inkubovány s radioaktivním izotopem, chrómem 51, který je přijímán buňkami. Dále jsou tyto radioznačené buňky kokulturovány s izolovanými imunitními buňkami, které jsou předmětem zájmu, také nazývanými efektorové buňky, v kulaté dno, 96 jamkové destičce, aby se usnadnila interakce mezi těmito dvěma typy buněk.
celkové nastavení testu zahrnuje inkubaci určitého počtu cílových buněk s různými koncentracemi imunitních buněk spolu s příslušnými kontrolami. Kokultura umožňuje efektorovým buňkám indukovat apoptózu a lýzu v cílových buňkách, což vede k uvolnění intracelulárního Chromu 51 do supernatantu. Potom se v předoptimizovaném časovém bodě odebere supernatant obsahující uvolněný chrom ze všech jamek. Chrom 51, který je radioaktivní, spontánně podléhá radioaktivnímu rozpadu, aby emitoval gama záření. Hladiny gama záření v supernatantech ze všech jamek v testovací destičce představují kvantifikovatelný výstup lýzy cílových buněk. To se měří pomocí čítače Gama, který se pak používá ke stanovení cytotoxického potenciálu imunitních buněk.
nejprve se cílové buňky, lidská melanomová buněčná linie WM793 v tomto příkladu, připraví do jediné buněčné suspenze. Chcete-li to provést, nejprve vyjměte médium z baňky tkáňové kultury a promyjte buňky pěti mililitry 1X PBS. Dekantujte PBS a poté přidejte jeden mililitr trypsinu na desku přibližně dvě minuty. Jemně poklepejte na baňku, abyste uvolnili buňky z povrchu baňky, a poté do baňky přidejte pět mililitrů média RPMI. Pipetujte médium nahoru a dolů, abyste shromáždili buňky, a přidejte tuto suspenzi do kuželové zkumavky o objemu 15 mililitrů.
vložte zkumavku do odstředivky na pět minut při 1200 ot / min. Poté vyjměte médium z trubice a ujistěte se, že nedošlo k narušení buněčné pelety. Jemně švihněte spodní část zkumavky, abyste narušili buněčnou peletu, a do zkumavky přidejte 10 mililitrů média. Potom opatrně pipetujte médium nahoru a dolů, aby se buňky dostaly do suspenze. Dále určete koncentraci buněk pomocí hemocytometru a přeneste dva mililitry původní buněčné suspenze do nové kuželové trubice o objemu 15 mililitrů. Umístěte zkumavku do odstředivky a peletujte buňky při 12 stovkách otáček za minutu po dobu pěti minut. Po odstředění vylijte přebytečné médium z trubice do nádoby na odpad. Zkumavku krátce promíchejte, aby se buněčná peleta znovu promíchala v malém objemu média, které zůstalo.
dále se připravte na použití Chromium 51 přesunutím do laboratorního prostoru vyhrazeného pro tuto konkrétní radioaktivitu. Mělo by existovat dostatečné olověné stínění pro bezpečné skladování a používání Chromu 51 během všech kroků, jakož i správné značení označující, kde jsou vzorky s chromem 51 uchovávány. Geigerův čítač vybavený palačinkovou sondou je také nezbytný, aby sloužil v prostoru pro možnou kontaminaci.
po nastavení pro správné použití radioaktivity přidejte 100 mikrokurzí Chromu 51 přímo do suspenze cílových buněk. Poté přidejte do zkumavky malý kousek radioaktivní pásky, abyste označili, že vzorek a zkumavka jsou nyní radioaktivní. Umístěte zkumavku do inkubátoru 37 stupňů Celsia s olověným štítem a inkubujte po dobu jedné hodiny, metáním zkumavky každých 15 až 20 minut.
během označování cílových buněk připravte jednu buněčnou suspenzi efektorových buněk. V tomto příkladu byly mono jaderné buňky lidské periferní krve nebo PDMC izolovány z plné krve standardní centrifugací gradientu hustoty na koncentraci 5 krát 10 až 6. Přeneste tuto suspenzi efektorových buněk do zásobníku činidla na jedno použití a poté přidejte 200 mikrolitrů této suspenze do každé jamky řady B v 96 jamkové desce s kulatým dnem. Dále přidejte 100 mikrolitrů RPMI do každé jamky v řadě C až G desky.
nyní začněte provádět sériová ředění Pbmc tak, aby měla řadu čísel efektorových buněk tím, že nejprve odstraníte 100 mikrolitrů buněk v jamkách v řádku B a přidáte to do řádku C. potom efektorové buňky dále zředíte přenosem 100 mikrolitrů buněk z řádku C do řádku D. pokračujte v sériovém ředění. Jakmile je dosaženo řádku G, přesuňte 100 mikrolitrů z jamek a ponechte konečný objem 100 mikrolitrů v každé jamce v této řadě. Dále přidejte 100 mikrolitrů média tkáňové kultury do jamek v řadě a, aby sloužily jako kontrola spontánního uvolňování chrómu 51 z cílových buněk, protože do této řady by neměly být přidávány žádné efektorové buňky. Poté vložte desku do inkubátoru 37 stupňů Celsia, dokud nejsou cílové buňky připraveny k přidání.
po inkubační době vyjměte cílové buňky z inkubátoru a promyjte 5 mililitry FBS, aby se odstranil přebytečný Chrom 51. Poté vložte zkumavku do určené odstředivky a odstřeďujte při 1200 ot / min po dobu 5 minut. Odstraňte radioaktivní mytí FBS do vhodné nádoby na odpad a opakujte promývací krok opětovným promícháním pelet v čerstvém 5 mililitry FBS. Umístěte zkumavku do určené odstředivky a buňky znovu otáčejte rychlostí 1200 ot / min po dobu 5 minut. Odstraňte druhé mytí a pomocí Geigerova počítadla zkontrolujte, zda pelety neobsahují radioaktivitu. Nakonec peletu znovu promícháme v 10 mililitrech kompletního média a nalijeme suspenzi cílových buněk označenou chromem 51 do zásobníku činidla na jedno použití. Poté přidejte 100 mikrolitrů těchto značených cílových buněk do každé jamky 96jamkové efektorové buněčné destičky. Dále přidejte 100 mikrolitrů 1% NP-40 ve vodě do jamek v řadě H, abyste lyzovali všechny cílové buňky v každém řádku. Tyto studny budou použity jako kontrola pro stanovení celkového počtu za minutu nebo cpm.
Nyní, když je deska připravena, zajistěte víko přidáním malého kousku pásky na každou stranu desky a položte na víko kus radioaktivní pásky, aby bylo zřejmé, že obsahuje chrom 51. Poté umístěte desku do odstředivky označené pro manipulaci s radioaktivními vzorky. Pokud se používá pouze jedna experimentální deska, přidejte do odstředivky vyvažovací desku. Nastavte odstředivku na 1200 ot / min a nastavte desku na rychlost. Jakmile je rychlost, zastavte stroj. Vyjměte desku z odstředivky. Poté umístěte desku do inkubátoru 37 stupňů Celsia s malým kouskem olověného stínění přes desku pro větší bezpečnost. Inkubujte po dobu 16 hodin, aby cílové buňky mohly lyzovat.
na konci inkubační doby opatrně odstraňte pásku kolem okraje desky a sejměte víko. Dále umístěte sklízecí rám na desku a ujistěte se, že malé filtrační kotouče jsou na místě pro každou bavlněnou zátku. Nyní pomalu a jemně zatlačte bavlněné zátky do jamek. Po přibližně deseti sekundách uvolněte tlak na bavlněné zátky a poté přeneste bavlněné zátky na trubkové proužky. Umístěte každou z těchto zkumavek do sekundární zkumavky FACS. Nakonec vložte zkumavky FACS na počítadlo gama a spusťte vzorky, abyste kvantifikovali množství chrómu 51 uvolněného v každém stavu. Pečlivě Zaznamenejte pořadí, ve kterém byly trubky vloženy do pultu.
zde byly do prvních 3 pruhů přidány nestimulované Pbmc a do pruhů 4 až 6 byly přidány CPG stimulované Pmbc. V tomto příkladu, počty za minutu byly zadány do buněk tabulky stejným způsobem, jako byly vzorky rozloženy na původní desce, a byly vypočteny průměry triplikátů. Například pro první podmínku byly buňky A1, A2 a A3 zprůměrovány v buňce I3. Jakmile jsou průměry stanoveny, lze pomocí tohoto vzorce vypočítat procento specifické lýzy pro každou podmínku. Například pro výpočet procenta specifické lýzy pro nestimulované buňky, které měly poměr 50 až 1 efektorových buněk k cílovým buňkám, byl spontánní CPM, který je v tomto příkladu 1164, 67, odečten od experimentálního CPM, 1129. 67. Toto číslo pak může být děleno rozdílem mezi maximálním CPM a spontánním CPM a poté vynásobeno 100, čímž se získá procentuální specifická lýza. To se pak vypočítá pro každou podmínku. Tato data pak mohou být grafována tak, aby ukazovala srovnání poměru E K T s procentuální specifickou lýzou pro nestimulované Pbmc, a CpG stimulované Pbmc. V tomto příkladu efektorové buňky stimulované CPG účinněji zabíjely cílové buňky, protože se zvýšil poměr efektorových buněk k cílovým buňkám. Toto zvýšení nebylo pozorováno u nestimulovaných Pbmc, což naznačuje, že stimulace CPG je nezbytná pro pozorované zvýšení lýzy cílových buněk.