srovnávací měření CNP a NT-proCNP ve vzorcích lidské krve: metodické hodnocení

Úvod

natriuretický peptid typu C (CNP), identifikovaný v roce 1990 Sudoh et al., je nejstarším členem rodiny natriuretických peptidů . CNP selektivně stimuluje lidský natriuretický peptidový receptor 2 (NPR2), který aktivuje cGMP-dependentní kinázu (cGK) zvýšením intracelulární koncentrace cGMP . Kromě toho CNP váže NPR3 a následně deaktivuje proteinkinázu A inhibicí adenylátcyklázy závislou na GI-proteinu . CNP má anti-proliferativní a anti-migrační vlastnosti a byl také identifikován jako relaxační faktor odvozený od endotelu . Kromě toho CNP inhibuje neointimální restenózu, snižuje vaskulární konstriktivní remodelaci a srdeční ischemii-reperfuzní poškození . CNP hraje důležitou roli v růstu kostí, reprodukci, růstu nervů, reendotelizaci, stejně jako funkce ledvin, pankreatu a srdce . Kromě toho bylo nedávno uznáno, že CNP se podílí na vývoji tvorby aterosklerotických plaků .

vzhledem k množství funkcí CNP dosáhl tento peptid v posledních letech rostoucího zájmu o kardiovaskulární výzkum. Studie týkající se koncentrací CNP ve vzorcích krve jsou však nekonzistentní. Některé z těchto studií měřily koncentrace CNP nebo jeho amino-terminálního pro-peptidu (NT-proCNP) ve vzorcích séra a jiné používaly vzorky plazmy . Bohužel dosud nebyly hlášeny podrobnosti o možných zpožděních při odběru vzorků krve a následném zpracování vzorků. V dosud dostupné literatuře neexistují žádné údaje o rozdílu koncentrací CNP/NT-proCNP mezi vzorky séra a plazmy. Také vliv zpoždění zpracování vzorků krve zůstává nejasný. Kromě toho se koncentrace CNP ve vzorcích séra a plazmy výrazně lišila (Tabulka 1). Cílem této studie proto bylo odpovědět na následující metodologické otázky: (1) způsobuje zpožděné zpracování vzorků krve uložených při pokojové teplotě zkreslení? (2) Existuje nějaký rozdíl mezi sérovými a plazmatickými koncentracemi CNP nebo NT-proCNP? (3) jsou tyto rozdíly závislé na čase?

metody

studovali jsme 12 mužských dobrovolníků (průměrný věk 29 ± 2 roky, normální hmotnost, žádná farmakoterapie, žádná anamnéza kardiovaskulárních nebo jiných onemocnění, 3 kuřáci). Od všech zkoumaných subjektů byl získán informovaný souhlas. Trojčata vzorků krve nalačno byla odebrána od všech dobrovolníků v 8 hodin ráno. Vzorky krve byly odebrány pomocí sběrného systému 7,5 ml S-Monovette® (Sarstedt, Nümbrecht, Německo) obsahujícího buď aktivátor srážení (Kaolin) pro vzorky séra, sodík-citrát pro vzorky plazmy nebo draslík–EDTA pro vzorky plné krve. Všechny vzorky pro základní analýzy byly okamžitě centrifugovány při 2 000 × g po dobu 10 minut při 4°C a supernatant byl uchováván při -70°C až do analýzy. Pro střednědobé analýzy (30 minut nebo 2 hodiny) byly vzorky plazmy centrifugovány při 2 000 × g po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Supernatant byl odstraněn a skladován při pokojové teplotě po dobu 30 minut nebo 2 hodin. Po srážení krve byly vzorky séra zpracovány identicky se vzorky plazmy. Supernatant byl uložen a také skladován při pokojové teplotě po dobu 30 minut nebo 2 hodin. Plné vzorky krve byly skladovány při pokojové teplotě bez odstředění. Po 30 minutách nebo 2 hodinách byly plné vzorky krve centrifugovány při 2 000 × g po dobu 10 minut při 4°C. Supernatant byl odstraněn a skladován při -70°C až do analýzy. Koncentrace CNP byla měřena pomocí soupravy CNP-22 EIA (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Německo) podle protokolu výrobce. Koncentrace NT-proCNP byla měřena pomocí soupravy NT-proCNP EIA (Biomedica, Vídeň, Rakousko) podle protokolu výrobce. Pro srovnání mezi skupinami byla použita jednosměrná ANOVA. Pro párová srovnání byl použit t-test. Údaje jsou uvedeny jako průměr ± směrodatná odchylka (SD) nebo 95% interval spolehlivosti (95%-CI). Statistická významnost byla předpokládána při p < 0,05. Data byla analyzována pomocí MedCalc® pro Windows, verze 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgie).

výsledky

jak je znázorněno na obrázku 1a, výchozí koncentrace CNP ve vzorcích séra, plazmy a plné krve byly 0,997 ± 0,379 ng / ml, 1,933 ± 0,699 ng / ml a 0,991 ± 0,489 ng/ml. Plazmatické koncentrace CNP byly ve všech časových bodech významně vyšší ve srovnání se vzorky séra a plné krve (ANOVA, p = 0, 001 na začátku studie, p < 0, 001 po 30′ min. a p = 0,003 při 120′ min.). Nebyl pozorován žádný významný rozdíl mezi sérem a plnými krevními vzorky v kterémkoli časovém bodě (ANOVA, p > 0,05). Výchozí koncentrace NT-proCNP ve vzorcích séra, plazmy a plné krve byly 58,5 ± 28,3 pg / ml, 60,3 ± 23,9 pg / ml a 50,7 ± 21,4 pg/ml (Obrázek 1b). Nebyl zjištěn žádný významný rozdíl mezi skupinami v žádném časovém bodě (ANOVA, p > 0,05). Ve vzorcích plné krve se koncentrace laktátu významně zvýšila po 2 hodinách ve srovnání s výchozí hodnotou (3,2 ± 0,8 mM vs. 2,0 ± 0,6 mM, p < 0,001). Kromě toho se hodnota pH snížila ze 7,34 ± 0.03 na začátku do 7, 29 ± 0, 03 po 2 hodinách (p < 0, 001).

diskuse

naše studie odhalila, že CNP a NT-proCNP jsou stabilní v séru a ve vzorcích plné krve po dobu nejméně dvou hodin při pokojové teplotě. V důsledku toho není stabilita peptidu CNP s největší pravděpodobností ovlivněna žádným zpožděním zpracování vzorku po dobu nejméně dvou hodin. ProCNP již bylo hlášeno (protokol výrobce, neznámé podmínky uchovávání vzorků krve), že je stabilní po dobu nejméně 2, 5 hodiny. V souladu s tím naše experimenty potvrdily stabilitu NT-proCNP i při pokojové teplotě. Koncentrace NT-proCNP ve všech typech vzorků zůstala konstantní během časového průběhu po dobu až 2 hodin, což naznačuje dlouhodobou stabilitu tohoto proteinu. Jak je uvedeno v tabulce 1, průměrná koncentrace NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg/ml) měřené v této studii byly v rozmezí hlášených hodnot (viz tabulka 1) zdravých jedinců (3,7-432 pg / ml).

na rozdíl od NT-proCNP byla koncentrace CNP významně vyšší ve vzorcích plazmy ve srovnání se vzorky séra a plné krve (Obrázek 1). Zatím ani naše skupina, ani technická služba výrobců nenalezly žádné důkazy týkající se vlivu typu vzorku na test ELISA použitý v této studii. Na začátku studie však byly supernatant plazmy a plné krevní vzorky identické s výjimkou použitého typu inhibitoru srážení krve. Tento inhibitor byl citrát sodný v plazmatické skupině a EDTA ve skupině s plným krevním vzorkem. Plné vzorky krve odhalily srovnatelné výsledky se vzorky séra (p = 0, 98). Proto je nejpravděpodobnější, že citrát sodný může významně ovlivnit naměřenou koncentraci CNP v plazmě a následně falšovat výsledky dosažené touto technikou.

neočekávaně byly výchozí koncentrace CNP ve vzorcích plazmy i séra asi tisíckrát vyšší než v jiných zprávách (Tabulka 1). Ve všech těchto studiích byla pro stanovení koncentrací CNP použita radioimunoanalýza (RIA-Kit). Naproti tomu ve dvou dalších studiích byly naměřené koncentrace CNP ve vzorcích séra a plazmy srovnatelné s našimi výsledky, pokud jde o velikost dimenze . Je zajímavé, že v posledních studiích byla použita stejná Elisa-Kit jako v našem vyšetřování. Ani po rozsáhlém vyhodnocení různých vnitřních a vnějších faktorů nebylo možné nalézt uspokojivé vysvětlení tohoto rozporu. Kontrolní měření pomocí exogenního CNP v lidském séru odhalila nevýznamnou chybu měření +7, 8% (95% – KI: -). Peptid CNP použitý pro referenční křivku byl syntetizován samotným výrobcem (Phoenix). Naproti tomu peptid CNP použitý jako „exogenní“ kontrola poskytl Bachem. Jak oba výrobci ujistili, sekvence aminokyselin byly identické a v obou peptidech byly vytvořeny disulfidové vazby.

výsledky měření vnitřní kontroly však lze shrnout následovně: Za prvé, kontrolní měření provedená v naší studii ukázala, že soupravy ELISA byly správně používány v souladu s pokyny výrobce. Za druhé, měření pomocí kontrolních vzorků potvrdila vhodnost použité standardní křivky. Za třetí, kontrolní vzorky séra obsahující exogenní CNP odhalily přijatelnou přesnost a výsledky byly v očekávaném řádu. Začtvrté, vyšší koncentrace CNP ve vzorcích plazmy je s největší pravděpodobností artefaktem způsobeným citrátem sodným.

jak uvádí Clerico a spolupracovníci, jsou také známy srovnatelně velké rozdíly ve výsledcích mezi různými metodami RIA a EIA, například ANP a BNP . Clerico a spolupracovníci dospěli k závěru, že velké rozdíly v těchto výsledcích jsou s největší pravděpodobností způsobeny specificitou použitých monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, návrhem imunoanalytického systému (konkurenční vs. nesoutěžní test), použitou analytickou matricí (sérum vs. EDTA vs. heparinizovaná plazma) a množstvím cirkulujících forem natriuretických peptidů, jak bylo dříve uvedeno pro imunoanalýzy ANP a BNP . Tyto metodologické zdroje zaujatosti mohou být také myslitelné pro testy CNP a NT-proCNP, a tak vysvětlují velký rozdíl ve výsledcích v citovaných studiích(Tabulka 1).

Omezení studie

uznáváme, že velikost vzorku 12 je příliš malá na to, abychom dospěli k závěru, že není vůbec žádný rozdíl. Ze statistického hlediska by však bylo důležité specifikovat, jak velký musí být rozdíl, aby měl lékařský význam. Pokud je nám známo, ten není dosud jasně definován. Proto byly na obrázku uvedeny prostředky a intervaly spolehlivosti 95% všech opatření, aby si každý čtenář mohl z dat také vyvodit vlastní interpretaci.

s ohledem na sérové a plazmatické koncentrace je třeba uvést, že hodnoty uvedené v tabulce 1 byly měřeny různými metodami (RIA, ELISA) u pacientů trpících různými chorobami. Bylo by velmi užitečné porovnat CNP-RIA s testy CNP-ELISA přímo pomocí stejných vzorků, protože tisícinásobný rozdíl v řádu zůstává patrný. Bohužel, RIA testy měření nebyly k dispozici v naší laboratoři. Pro koncentraci NT-proCNP bylo toto srovnání zkoumáno společností Olney a spolupracovníky, což ukazuje, že komerční ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Vídeň, Rakousko) poskytla hodnoty, které byly v průměru 21% (rozmezí 11-52%) hodnot RIA. Křížová validace referenčního standardu soupravy ELISA pomocí testu RIA prokázala nesouhlas ve výši 15% .

souhrn

měření CNP a NT-proCNP nebyla s největší pravděpodobností ovlivněna zpožděním procesu vzorku nebo typem vzorku krve (s výjimkou CNP ve vzorcích plazmy). Pro vzorky plazmy byly pro test CNP ELISA použitý v této studii vhodné pouze antikoagulované vzorky krve EDTA. V důsledku toho by koncentrace CNP a NT-proCNP mohla být použita v klinických aplikacích za účelem stanovení účinků CNP. Mělo by se také vzít v úvahu, že koncentrace NT-proCNP, která je pouze vedlejším produktem aktivního peptidu, může skrývat skutečnou povahu CNP. Nesoulad v naměřených koncentracích CNP stanovený buď pomocí RIA-testů, nebo pomocí ELISA-testů však stále zůstává nevysvětlený, ale zdá se, že je s největší pravděpodobností způsoben metodologickými problémy. Proto , jak je doporučeno pro ANP a BNP, musí být imunoanalýzy pro CNP v budoucnu také standardizovány nebo harmonizovány.