skryté na očích-vysoce hojné a rozmanité planktonické Sladkovodní Chloroflexi

hojnost a rozmanitost kmene Chloroflexi ve sladkovodním prostředí

na základě 16S rRNA četli hojnost ze 117 metagenomů z jezer, nádrží a řek tvořili zástupci kmene Chloroflexi až 7% prokaryotické komunity v epilimnionu (obr. 1a, b), avšak s velkými výkyvy. Podobně jako předchozí pozorování, linie CL500-11 dominovala vzorkům hypolimnionu (dosáhla nejméně 16% ve všech kromě jednoho vzorku a téměř 27% V jednom vzorku z jezera Biwa) (obr. 1c), kromě méně známé skupiny označované jako klastr TK10. Většina sekvencí 16S rRNA souvisejících s TK10 v databázi SILVA pochází z půdy, lidské kůže nebo neznámých metagenomických vzorků, zatímco pouze čtyři (1,5%) pocházejí z čerstvých vod (další soubor 1: obrázek S1A).

Epilimnionovým vzorkům překvapivě dominovaly sekvence přidružené k „SL56 marine group“ (až ca. 5% Celkové prokaryotické komunity). Sl56-související sekvence SILVA byly získány ze sladkovodního jezera a datových sad Global Ocean Series (GOS). Vzorek GOS, ze kterého byly popsány, je však ve skutečnosti Sladkovodní dataset, jezero Gatun (Panama). Z našich výsledků je to zcela zřejmé (obr. 1; další soubor 1: Obrázek S2) že tento shluk se trvale vyskytuje pouze v jezerech, nádrže, a řeky, ale ne v mořském prostředí, což naznačuje, že byl nesprávně označován jako „mořská skupina“.“Bylo zjištěno, že další skupina sekvencí, označovaná jako JG30-KF-CM66, popsaná z různých prostředí (hromada odpadu z těžby uranu, půda, sladká voda, sloupec mořské vody a sediment), byla přednostně distribuována v řekách (zejména v Amazonii) než jezera (obr. 1a, b), i když při velmi nízké hojnosti (maximálně 1% celkových prokaryot). Podobné hojnosti byly nalezeny v brakickém Kaspickém moři (hloubky 40 m a 150 m) (Další soubor 1: obrázek S2).

ve všech zkoumaných sladkovodních metagenomických datech jsme však nenašli žádnou podporu pro přítomnost hvězdokupy SAR202 ani její Sladkovodní sestry clade CL500-9. V mořských a brakických stanovištích se SAR202 téměř výhradně vyskytuje v tmavých afotických vrstvách, kde tvoří až 30% prokaryotické komunity . Pokud se na sladkovodních stanovištích vyskytují nějaké kmeny SAR202, rozhodně nejsou příliš hojné nebo možná nepocházejí z vodního sloupce v původní zprávě (další soubor 1: obrázek S1). Celkově, i když relativní hojnost Chloroflexi ve Sladkovodní epilimnii je mnohem nižší než v hlubších vodách, jsou domovem bohaté a rozšířené sbírky nových skupin.

s těmito pozorováními je také zřejmé, že ve zde zkoumaných vodních prostředích (Sladkovodní, brakické a Mořské) je rozmanitost zástupců Chloroflexi podstatně odlišná, přičemž sladkovodní prostředí obsahuje fylogeneticky rozmanitější sortiment skupin než brakické nebo mořské. Kromě toho existují jasné důkazy o přítomnosti sladkovodních skupin (např., SL56) a pouze mořské a brakické skupiny (SAR202), které opakují, že slanost je bariérou vůči mikrobiálním přechodům stanovišť mezi sladkovodními a mořskými ekosystémy . V žádném případě to není nepřekonatelná bariéra jako relativně nedávné přechody ze sladké vody do mořské (např. Sladkovodní “ Ca. Methylopumilus spp.“a marine OM43) a obráceně (marine Pelagibacter a sladkovodní LD12) byly navrženy. Je však pravděpodobné, že skupiny nalezené v brakických prostředích mohou být jednoduše lépe „připraveny“ pro úspěšnější nájezdy. Najdeme příklady skupin, které se vyskytují ve sladkovodních a brakických metagenomech (JG30-KF-CM66 a CL500-11).

hlavní Sladkovodní zástupci Chloroflexi

automatizované vázání spojů souvisejících s Chloroflexi ze sestav každých 57 datových souborů patřících do 14 různých prostředí (28 jezer/nádrží, 26 řek a 3 brakické datové sady) vedlo k segregaci 102 Mag (genomů sestavených metagenomem) celkem (další soubor 2: Tabulka S1). Fylogenomická analýza Mag s 30% nebo vyšší úplností (n = 53)ukazuje, že pozoruhodně vysoká rozmanitost Mag byla získána prakticky ze všech známých tříd Chloroflexi (obr. 2). Třicet pět časopisů představovalo tři samostatné nové linie na úrovni třídy bez dostupných kultivovaných zástupců (SL56, TK10 a JG30-KF-CM66).

zatímco fluorescenční in situ hybridizace následovaná katalytickou depozicí reportérů (CARD-FISH) detekovala vysoké počty buněk CL500-11 V Epilimnionu v jezeře Curych během částečných mixů v zimě, nejvyšší úrovně hojnosti byly vždy nalezeny v hlubších zónách, v obou Curyšských jezerech (až 11% všech prokaryot; obr. 3a) a jezero Biwa (až 14%; obr. 3d). Hojnost CL500-11 negativně korelovala s teplotou i koncentrací chlorofylu a (další soubor 1: Obrázek S3). Ve vzorcích nádrže Řimov byl však CL500-11 pod detekčním limitem (< 0,18%), což naznačuje, že toto relativně mělké stanoviště (maximální hloubka 43 m) nepředstavuje pro tuto skupinu bakterií preferovaný výklenek (další soubor 1: obrázek S4). CL500-11 buňky byly dříve vizualizovány kartovými rybami a ukázaly se jako velké zakřivené buňky . Podobné tvary a velikosti byly pozorovány u vzorků ryb z Curyšského jezera s průměrnými délkami 0,92 µm (rozmezí 0,4-1,6 µm; n = 277) a šířkami 0,28 µm (rozmezí 0,19–0,39 µm). Analýza objemů buněk (medián 0.06 µm3) a biomasa pro tento klastr ve srovnání se všemi prokaryoty (obr. 3c) naznačuje extrémně vysoký příspěvek populace CL500-11 k celkové mikrobiální biomase. Jejich poměr biomasy k hojnosti je téměř 2, tj. při 10% hojnosti tvoří téměř 20% celkové prokaryotické biomasy, což naznačuje pozoruhodnou adaptaci na relativně oligotrofní hluboký hypolimnion, dosahující vysokých populací i při jejich velkých velikostech buněk.

získali jsme celkem 11 časopisů (10 sladkých vod, 1 brakických) pro CL500-11. Všechny čtyři časopisy jezera Biwa z různých měsíců tvoří jediný druh. Zdá se však, že dva druhy z Curyšského jezera koexistují po celý rok (březen, květen a listopad), přičemž jeden druh se rozvětvuje společně s dříve popsaným MAG z Michiganského jezera (CL500-11-LM)a ostatní druhy mají blízké zástupce také v brakickém Kaspickém moři (> 95% ANI) a podobné vzorce náboru metagenomických fragmentů (obr. 2 a 4c). Navrhujeme kandidátský Rod Profundisolitarius (Pro.fun.di.so.li.ta’ri.us. L. adj. profundus hluboký; l. adj. solitarius sám; n. L.masc. n. Profundisolitarius jediný samotář z hlubin) uvnitř Candidatus Profundisolitariaceae fam. Novum. pro cluster CL500-11 (třída Anaerolinea).

na druhé straně je skupina SL56 dominantním rodem v Řimovské nádrži (nejvýše 1.1%), a to jak analýzou rRNA 16S, tak analýzou CARD-FISH (obr. 1 a 3). Maximální hojnost byla téměř vždy nalezena kolem 5-20 m při teplotách ca. 15 °C, což naznačuje, že tato skupina je primárně epilimnetická (další soubor 1: Obrázky S3 a S4). Tato oblast vodního sloupce (termoklin) má kromě teplotního gradientu také výrazně nižší intenzitu světla ve srovnání s povrchovými vrstvami. Nejvyšší výskyt sinic Planktothrix rubescens přizpůsobený slabému osvětlení v hloubce kolem 13 m ve stratifikovaných letních profilech Curyšského jezera se shoduje s maximálním množstvím SL56 (další soubor 1: obrázek S3). Buňky SL56 jsou tyčovité a protáhlé (průměrná délka = 0,68 ± 0,25 µm; průměrná šířka = 0,35 ± 0,09 µm; n = 6; obr. 3e). Podle našeho nejlepšího vědomí, Toto je první zpráva o sladkovodní specifické skupině Chloroflexi, která se zdá, že se daří v epilimnionu.

bylo získáno celkem 14 Magů pro shluk SL56 (1 obsahující 16S rRNA) a tvoří třídní linii, značně odlišnou od všech známých Chloroflexi (obr. 2). Jejich jediným příbuzným je jediný MAG (Chloroflexi CSP1-4) popsaný ze sedimentu zvodnělé vrstvy . 16S rRNA clade, ke které se CSP1-4 údajně přidružuje, je Gitt-GS-136 a většina sekvencí v této clade pochází buď z půdních nebo říčních sedimentů (informace z taxonomie SILVA). Nebyli jsme však schopni detekovat žádnou 16S rRNA sekvenci (částečnou nebo úplnou) v dostupné genomové sekvenci CSP1-4. Další nejbližší klad (v taxonomii rRNA 16S) k Gitt-GS-136 a SL56 je KD4-96, jehož sekvence byly získány ze stejných stanovišť (viz další soubor 1: obrázek S1B). Kromě toho všechny známé sekvence rRNA 16S ze skupiny SL56 pocházejí pouze z čerstvých vod (jezero Gatun, Curyšské jezero atd.). Dohromady se zdá, že nejbližší fylogenetičtí příbuzní sladkovodního rodu SL56 obývají půdní nebo sedimentární stanoviště.

Sl56 MAGs byly rekonstruovány z geograficky vzdálených lokalit (Evropa ,Severní a Jižní Amerika, obr. 2) a bylo možné detekovat nejméně devět různých druhů (ANI, obr. 1). Ze vzorků jezera Biwa nebyly získány žádné časopisy, ale tři sekvence rRNA 16S byly získány v nespojených spojích. Rekonstruované časopisy jsou globálně distribuovány podél sladkovodních datových souborů z epilimnionu (žádný nebyl detekován v hlubokém hypolimnionu) (obr. 4 a další soubor 1: obrázek S6). Z Kaspického moře nebyly rekonstruovány žádné časopisy SL56 a žádný z obnovených genomů rekrutovaných z brakických metagenomů. Navrhujeme kandidátský Rod Limnocylindrus (Lim. no. cy. lin ‚ Drus. Gr. fem. n. limne a lake; L.masc. n. cylindrus a válec; n. L.masc. n. Limnocylindrus válec z jezera) uvnitř Limnocylindraceae fam. Novum., Limnocylindrales ord.nov., a Limnocylindria classis. Novum. pro klastr Chloroflexi SL56.

sekvence rRNA TK10 16S byly nalezeny při nejvyšším množství ve vzorcích Hypolimnionu jezera Biwa (maximální ca. 2%) (obr. 1a, c). Buňky byly vejčité s odhadovanou délkou 1,08 ± 0,1 µm a šířkou 0,84 ± 0,09 µm (n = 12; obr. 3e). Koherentní shluk devíti Magů (tři obsahující 16S rRNA další soubor 1: Obrázek S1) z geograficky vzdálených míst (Evropa ,Asie a Severní Amerika) byl získán. Tyto pozoruhodně kosmopolitní organismy prosperující v hlubších vrstvách jezera nejsou příliš rozmanité (hodnoty ANI > 95%). Tato zdánlivá nízká rozmanitost může být důsledkem velmi specializovaného výklenku nebo co je pravděpodobnější, výsledek relativně nedávného přechodu na sladkou vodu, podobně jako “ Ca. Fonsibacter “ (LD12 Alphaproteobacteria). Zástupci rRNA č. 16S byli s jistotou detekováni v mořských nebo brakických metagenomech, ačkoli některé sekvence rRNA 16S databáze SILVA byly získány z mořských sedimentů a vodního sloupce (další soubor 1: obrázek S1). Nejbližší příbuzní z 16S rRNA se zdají být buď z půdy, nebo ze vzorků sedimentů, což naznačuje, že by to mohlo být jejich původní stanoviště. Zajímavé je, že klastr TK10 je také hluboce větvený, až po SL56 a CSP1-4 ve fylogenetickém stromu Chloroflexi obecně, a všichni ostatní zástupci Chloroflexi (MAGs nebo izolovat genomy) se zdají být pocházející z větve odlišné od obou těchto. Navrhujeme kandidátský Rod Umbricyclops (Um.bri.cy l.fem. N. umbra; l.masc. n. cyclops (od Gr. Kulaté oko; Cyclops) a cyclops; n. L.masc. n. Umbricyclops kulaté oko žijící ve stínu) uvnitř Umbricyclopaceae fam. Novum., Umbricyclopales ord.nov., a Umbricyclopia classis nov. pro tuto skupinu organismů.

výsledky CARD-FISH ukazují, že buňky JG30-KF-CM66 jsou kulovité s odhadovaným průměrem 0,56 µm (± 0,15 µm; n = 8; obr. 3e); nicméně velmi nízké proporce (< 0,28%) byly pozorovány u jg30-KF-CM66 v curyšském jezeře a hloubkových profilech nádrže Řimov (další soubor 1: Obrázky S3 a S4). Získali jsme 12 Magů, většinou z hlubinného vodního sloupce (osm brakických, čtyři Sladkovodní), jeden s téměř úplnou sekvencí 16S, která ve fylogenomické analýze vytvořila novou linii na úrovni třídy (obr. 1). Nejbližší příbuzní těchto časopisů jsou marine SAR202 a Dehalococcoidea (obr. 1 a další soubor 1: obrázek S1). V tomto klastru lze rozlišit odlišné skupiny brakických a sladkovodních časopisů. Navrhujeme kandidátský Rod Bathosphaera (Ba.tho.sphae ‚ ro. G. adj. bathos deep; L. fem. n. sphaera a sphere; n. L.fem. n. Bathosphaera a kokoidní bakterie žijící v hluboké) uvnitř Bathosphaeraceae fam. Novum., Bathosphaerales ord.nov., a Bathosphaeria classis. Novum. pro cluster Chloroflexi JG30-KF-CM66.

obnovili jsme také Magy ve třídách Chloroflexie (čtyři Magy) a Caldilineae (dva Magy) (obr. 1). Chloroflexia MAGs byly příbuzné s mesophilic Oscillochloris trichoides DG-6 v podřádu Chloroflexineae (jeden MAG) a tři další MAGs na Kouleothrix aurantiaca v Kouleotrichaceae fam. Novum. vytvoření nového podřádu, pro který navrhujeme název podřád Kouleothrichniae. Novum. Žádný z těchto časopisů nevykazuje žádný významný nábor fragmentů kromě místa jejich původu. Dalších 14 Magů z Kaspického moře přidružených ke klastru SAR202, které zde nebudou dále diskutovány, jak již byly popsány .

přínos sladkovodního Chloroflexi ve fungování ekosystémů

metabolické poznatky o rekonstruovaných Chloroflexi MAGs (úplnost ≥ 30%) naznačují primárně heterotrofní životní styl, který je v některých skupinách podpořen výrobou energie poháněnou světlem prostřednictvím rodopsinů (CL500-11, Chloroflexales, SL56 a TK10) nebo aerobní anoxygenní fototrofie (Chloroflexales). MAGs každého klastru obsahují nezbytné geny pro centrální metabolismus uhlohydrátů včetně glykolýzy, glukoneogeneze, a cyklus kyseliny trikarboxylové. Klíčové geny pro asimilační redukci sulfátu (3′-fosfoadenosin 5′-fosfosulfát (PAPS) syntáza a sulfát adenylyltransferáza) chyběly ve většině Mag, což naznačuje využití exogenních redukovaných sloučenin síry . Denitrifikační geny (dusičnan reduktáza / dusitan oxidoreduktáza alfa a beta podjednotky a dusitan reduktáza) byly nalezeny v MAGs TK10, ale následné enzymy odpovědné za produkci molekulárního dusíku chyběly.

ve vodním prostředí jsou Thaumarchaeota a sinice hlavním zdrojem kobalaminu a jeho korrinoidních prekurzorů pro velkou komunitu auxotrofů nebo těch málo schopných zachránit . De novo syntéza kobalaminu má vysoké metabolické náklady a hypotéza černé královny byla předložena jako vysvětlení důvodů, proč její výrobu provádí pouze několik členů komunity . Žádný z rekonstruovaných magnetů Chloroflexi nekóduje potřebné geny pro biosyntézu corrinových kruhů od nuly a chyběly také transportéry kobalaminu s vysokou afinitou (BtuBFCD) nebo jiných podezřelých korrinoidů (DET1174-DET1176), které mohou být důsledkem neúplnosti genomu nebo použití nepopsaného transportéru. Zdá se však, že ne všechny tyto organismy jsou auxotrofy, protože časopisy klastru JG30-KF-CM66 kódují geny pro cobinamid na záchrannou dráhu kobalaminu, která využívá importované korrinoidy spolu s meziprodukty z cesty biosyntézy riboflavinu k syntéze kobalaminu . Zh-chlor-G3 MAG obsahuje téměř úplnou záchranu kobalaminu (chybí pouze CobC) a biosyntéza riboflavinu (další soubor 3: Tabulka S2).

flagelární montážní geny byly přítomny v několika Mag klastrů CL500-11 a TK10 (obr. 1 a další soubor 3: Tabulka S2). Avšak složky L-A P-kroužku, které kotví bičíky na vnější membráně, chyběly ve všech bičíkovitých časopisech a referenčních genomech Chloroflexi (např. Kromě toho Mag a referenční genomy Chloroflexi nekódovaly geny pro biosyntézu LPS a nebyly detekovány žádné sekreční systémy, kromě Sec a Tat (chybí sekreční systémy typu I-IV, které jsou ukotveny ve vnější membráně) (další soubor 3: Tabulka S2). Srovnávací genomika dostupných genomů Chloroflexi podporuje závěry, že zatímco elektronové mikrografy naznačují dvě elektronové husté vrstvy ve většině členů tohoto kmene, Chloroflexi pravděpodobně vlastní jednu lipidovou membránu (monoderm) spíše než dvě (didermy).

Rhodopsinové sekvence byly rozpoznány v 18 Magech této studie od zástupců CL500-11, Chloroflexie, SL56 a TK10, které jsou fylogeneticky nejblíže xanthorhodopsinům (další soubor 1: Obrázek S8A a B) a jsou vyladěny tak, aby absorbovaly zelené světlo podobné ostatním sladkovodním a pobřežním rodopsinům (další soubor 1: obrázek S8C). Několik časopisů kóduje geny pro karotenoidní biosyntézu umožňující možnost karotenoidní antény, která je charakteristickým znakem xanthorhodopsinů . Z reziduí zapojených do vazby salinixanthinu (převládající karotenoid Salinibacter ruber) jsme našli překvapivě vysoké konzervované číslo (10 identických z 12 V alespoň jedné sekvenci rhodopsinu) (další soubor 1: Obrázek S8D), což naznačuje, že karotenoidní anténa může být vázán, takže alespoň některé z těchto sekvencí bonafide xanthorhodopsins.

dokonce i zástupci CL500-11 a TK10, kteří se primárně nacházejí v hypolimnionu během stratifikace, jsou schopni fototrofie; mohou však potenciálně přistupovat k fotické zóně během zimy a brzy na jaře mixis. Kromě fotoheterotrofie založené na rhodopsinu jsme také získali časopisy třídy Chloroflexie kódující geny pro proteiny reakčního centra fotosystému typu II L A M (pufL a pufM), bakteriochlorofyl a biosyntézu karotenoidů. Sekvence genu pufM se shlukují spolu s dalšími sekvencemi pufM souvisejícími s Chloroflexi (další soubor 1: obrázek S9). Nicméně, žádný důkaz pro fixaci uhlíku, buď cestou 3-hydroxypropionátu, nebo Calvin-Bensonovým cyklem, nebyl nalezen v žádném fotosystému nesoucím MAG, což by mohlo být důsledkem neúplnosti MAG. Může se také stát, že se jedná o aerobní anoxygenní fototrofy, které nefixují uhlík, např. Sladkovodní Gemmatimonadety a Acidobakterie (obě aerobní).

evoluční historie pelagického Chloroflexi

z fylogenomických analýz je zřejmé, že sbírka zástupců kmene Chloroflexi získaná v této práci, spolu se stávajícími genomovými sekvencemi z izolátů a časopisů, nabízí pouze částečný náčrt komplexní evoluční historie kmene obecně. Například nejvíce odlišné větve “ Ca. Limnocylindria „(cluster SL56) a “ Ca. Umbricyklopie “ (klastr TK10) nemá prakticky žádnou blízkou příbuznost kromě zvodnělé sedimentární MAG (příbuzný „Ca. Limnocylindria“). Související 16S rRNA klony však byly získány z půdy / sedimentů pro obě tyto skupiny, což naznačuje přechody k pelagickému životnímu stylu (Další soubor 1: obrázek S1B).

faktoring absence příbuzných mořských 16S rRNA sekvencí pro tyto skupiny, kromě jejich nedetekovatelnosti v mořských metagenomických datových sadách také naznačuje původ z půdy / sedimentu spíše než solného prostředí. I když nelze formálně vyloučit možnost mořského původu, zdá se nejpravděpodobnější směr přechodu z půdy/sedimentu na sladkovodní vodní sloupce. Navíc, vzhledem k tomu, že „Ca. Limnocylindria “ a “ Ca. Umbricyklopie „se rozcházejí před divergencí tříd Dehalococcoidea a marine SAR202 (třída“ Ca. Monstramaria“), které jsou dosud jediným ekologicky relevantním mořským Chloroflexi (první v mořských sedimentech a druhý v hlubinném Vodním Sloupci oceánu), je pravděpodobné, že chloroflexi předků vznikl v prostředí půdy / sedimentu. Úspěch mořského SAR202 v hlubokých oceánech je pozoruhodný; je to nejrozšířenější, možná numericky nejhojnější skupina Chloroflexi na planetě. Nicméně, některé 16S rRNA sekvence od jeho nejbližších příbuzných, Dehalococcoidea, byly také získány ze sladkovodních sedimentů, i když drtivá většina se zdá být z hlubokých mořských sedimentů (oba anoxické stanoviště).