chromatin Immunoprecipitation (ChIP) test je důležitou metodou pro monitorování transkripční regulace s odhalenými znalostmi interakcí mezi specifickými proteiny a genomovou oblastí DNA. Vzhledem k tomu, že proteiny vázající DNA (včetně transkripčních faktorů a histonů) v živých buňkách mohou být zesíťovány na DNA, kterou se váží, ChIP se používá k imunoprecipitaci komplexu protein–DNA z buněčných lyzátů vhodnou protilátkou. Imunoprecipitované komplexy jsou shromažďovány centrifugací a proteiny jsou eluovány pro další analýzu, jako je western blot a LC / MS. analýza nukleových kyselin je dosažena pomocí PCR, RT-PCR, cDNA sekvenování a microarray. Tento protokol poskytuje podrobný postup pro dosažení úspěšného testu čipů rychlým a efektivním způsobem.
činidla:
- 37% formaldehyd
- 1 M glycin
- buněčný lyzační pufr: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, s koktejlem inhibitoru 1× proteázy.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Přidá se 27 µL 37% formaldehydu na 1 mL kultivačního média, aby se dosáhlo konečné koncentrace při 1%, inkubují se buňky po dobu 10 minut při pokojové teplotě a pomalu se protřepávají na houpacím nebo třepacím zařízení.
2. Zkřížené spojení uhasíte přidáním 141 µL 1 M glycinu na 1 mL kultivačního média, abyste získali konečnou koncentraci při 125 mM, inkubujte buňky po dobu 5 minut při pokojové teplotě.
3. Pro plovoucí buňky: kleštinové buňky do 15 mL kónické zkumavky, odstředí se při 2 000 × g při 4°C po dobu 5 minut. Supernatant zlikvidujte a buňky dvakrát promyjte studeným PBS.
přeskočit na Krok 5.
4. U adhezivních buněk: vyjměte médium, buňky dvakrát omyjte studeným PBS. Seškrábněte buňky do PBS v 15 mL kónické zkumavce, odstředěte při 2 000 × g při 4°C po dobu 5 minut.
lýza a sonikace
5. Supernatant zlikvidujte a přidejte 1 mL pufru lýzy studených buněk na 1 × 107 buněk. Peletu znovu promíchejte několikrát pipetováním nahoru a dolů a inkubujte na ledu po dobu 10 minut.
6. Sonikát pro smyku chromatinu na 0,5~1 kb fragment. Vyhněte se pěně a udržujte vzorek na ledu.
poznámky:
- podmínky Sonikace by měly být optimalizovány v závislosti na modelu vzorku a sonikátoru. Obvykle bylo zjištěno, že pracuje šest 15sekundových impulzů následovaných 45sekundovými dobami odpočinku na výstupu 6.0. Pro analýzu velikosti fragmentu extrahujte malý objem celkové DNA z alikvotu stříhaného chromatinu a poté analyzujte na agarózovém gelu(1~2%).
- objemy se doporučuje, aby ≤ 1 mL pro udržení účinnosti sonikace.
7. Odstředí se při 12 000 × g při 4°C po dobu 10 minut a supernatant se uchovává.
8. Přeneste 0,5 mL supernatantu do čerstvého 1.5 mL zkumavka pro analýzu fragmentů DNA.
Imunoprecipitace
9. Do vzorku přidejte příslušné protilátky nebo normální IgG a inkubujte po dobu 15 minut v ultrazvukové vodní lázni při pokojové teplotě.
poznámky:
- vyberte IgG ze stejného druhu, kde byly protilátky produkovány.
- doba inkubace by měla být optimalizována v závislosti na protilátce a antigenu. U antigenů s nízkou úrovní exprese by inkubace mohla být provedena při 4°C přes noc na rotující plošině .
10. Připravte Protein a-agarózové korálky: kuličky třikrát promyjte 1 mL lyzačního pufru (bez inhibitoru proteázy), několik sekund odstřeďujte při 2000 × g při 4°C a potom supernatant zlikvidujte.
11. Zřeďte kuličky 1:1 lýzovým pufrem a do vzorku přidejte 50 µL.
12. Inkubujte při 4°C po dobu 30~45 minut v rotující plošině.
13. Odstřeďujte při 2000 × g po dobu 1 minuty při 4°C a potom supernatant zlikvidujte.
14. Perličky čtyřikrát promyjte 1 mL lyzačního pufru (bez inhibitoru proteázy), supernatant zlikvidujte.
čištění a analýza DNA
15. Promyté kuličky promícháme 100 µL 10% Chelex 100.
16. Pipetujte několik sekund nahoru a dolů a poté vzorek vařte 10 minut.
17. Odstřeďujte při 12 000 × g po dobu 1 minuty při pokojové teplotě a supernatant přeneste do čerstvé 1,5 mL zkumavky.
18. Čištění DNA pomocí sady pro čištění DNA nebo standardním protokolem pro extrakci fenolu: chloroformu.
19. Rozpusťte DNA s 50 µL ddH2O a použijte 2~10 µL vzorku DNA (25% reakčního objemu) v PCR reakcích
Přečtěte si o principu čipu
oslovte naši čipovou službu
pokud máte jakýkoli dotaz, kontaktujte nás na adrese: