rostliny a patogen
běžná ledová rostlina (Mesembryanthemum crystallinum L.) byla pěstována ve skleníku, jak je popsáno Kuźniak et al. . Po objevení se 3. listového páru byla jedna sada rostlin zavlažována 0,4 M NaCl, aby se indukoval metabolismus kyselin Crassulacean (rostliny CAM), zatímco druhá byla dále zavlažována vodou z vodovodu (rostliny C3). Po 12 dnech byla indukce CAM v rostlinách ošetřených NaCl potvrzena měřením denního malátu v míze listových buněk. Poté byly listy 2. párů listů rostlin C3 a CAM inokulovány Botrytis cinerea podle Kuźniak et al. .
chlorofyl a fluorescenční zobrazování
Mini verze zobrazovacího-PAM chlorofyl Fluorometru řady M (Walz, Effeltrich, Německo) vybaveného držákem listů byla použita k záznamu fluorescenčního zobrazování (Imaging-Pam M-series chlorofyl Fluorometr). Fluorometr je model Leaf clip pro polní aplikace. Držák listu zajišťuje, že list je držen vodorovně ke zdroji světla, aby se zabránilo heterogennímu osvětlení v různých oblastech vzorku listu. Pozice odběru vzorků byly vybrány tak, aby byly rovnoměrně rozmístěny podél středního okraje, nicméně se mírně lišily pro jakýkoli list kvůli jeho velikosti a morfologii, a technika umístění listů do držáku. Identifikovat účinky pouze biotického stresu, a aby se zabránilo zavedení artefaktů v postupu měření fluorescence chlorofylu, na listy nebyly použity žádné referenční značky umožňující odkazování na obraz listů. Fluorescence chlorofylu z listů obyčejných ledových rostlin byla získána definováním oblasti zájmů (nástroj AOI) pomocí zobrazovacího softwaru Win 2.41 a.
se zobrazovací PAM byl průběžně sledován aktuální fluorescenční výtěžek (Ft). Rostliny byly tmavé upraveny po dobu 20 minut. Při aplikaci saturačního pulsu byl stanoven výtěžek fluorescence tmavé úrovně (Ft = F0) a maximální výtěžek fluorescence (Fm). Maximální kvantový výtěžek PSII, Fv / Fm a kvantové výtěžky regulovaného a neregulovaného rozptylu energie v PSII, y(NPQ) a Y (NO) byly zobrazeny. FV / Fm byl vypočítán podle rovnice: Fv / Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ)byl vypočítán podle Kramer et al. podle vzorce: 1-Y (II) – 1/(NPQ + 1 + qL (Fm / F0-1−). Y (NO) byl vypočítán podle Kramer et al. rovnicí: Y (ne) = 1/. Proces zobrazování poskytuje pseudobarevné (indexovaný barevný režim) obrazy biologického materiálu s rozlišením 640 × 480 pixelů odpovídající zornému poli fyzikálních rozměrů 32 × 24 mm.
infikované listy rostlin C3 a CAM byly odebrány pro CHL fluorescenční analýzu v časovém bodě inokulace a byly odebrány. 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 a 72 hodin po očkování. CHL fluorescence byla měřena pro připojené listy 2. páru listů ze tří rostlin C3 a CAM pocházejících ze dvou nezávislých opakování pěstování rostlin. Každý list odebraný pro analýzu byl Samostatně promítán ve všech časových bodech (obr. 1). Reprezentativní série devíti snímků (jeden pro každý časový bod) Y (NO), Y(NPQ) a Fv/Fm pro C3 a CAM ledové rostliny byly zpracovány pro měření změn těchto parametrů ve vybrané oblasti listového listu promítaného v průběhu času. Pro srovnání y(NO), Y(NPQ) a Fv/Fm zprůměrovaly data z celých oblastí listů znázorněných na obr. Byly získány 2. Výsledky zarovnání obrazu a měření časoprostorového vzorování šíření biotického stresu v listech navrženou metodou byly ilustrovány na y (NO) obrazech.
ukázkové obrázky kvantového výnosu neregulovaného rozptylu energie v běžných listech ledových rostlin. Platí pro PSII Y (NO) fluorescenčních parametrů C3 (a–d) a CAM (e–h). Fragment listu obsahuje místo inokulace patogenu a příznaky šíření stresu
příklad obrázku obyčejného listu ledové rostliny C3 s vybranými oblastmi zájmu. Ručně provedené výběry v editoru firmwaru pokrývají infikované (1), bez příznaků (2) I oblasti midrib (3)
zarovnání obrazu
mechanismus sběru obrazových dat PAM v časové posloupnosti vede k přesunu fragmentu listu v zorném poli mezi jednotlivými časovými body (obr. 1). Kvůli změně polohy listu mají takové vlastnosti, jako je střed a místa očkování, odlišné umístění a orientaci. Kromě toho lze pozorovat účinek změny měřítka. Pro správné posouzení šíření napětí by se pole pohledu měla vzájemně synchronizovat za předpokladu, že jedno z nich bude referenčním (pevným) obrazem a zbytek obrázků bude zarovnán s pevným. Tento přístup je v lékařském zobrazování znám jako registrace obrazu . Základním registračním úkolem pro fluorescenční obrazy je najít transformaci „podobnosti“ sestávající z vhodné rotace, překladu a škálování. Ohýbání a skládání listů ze stresu se vyskytuje pouze v místních oblastech jednotlivých obrazů a má menší význam pro globální zarovnání obrazu. Mohou být kompenzovány ve fázi registračního postprocesingu nelineárními transformacemi, jako jsou např. tenké desky, povrchové drážkování a zobrazení démonů .
fluorescenční snímky jsou pořízeny jako série snímků v předem definovaných časových intervalech přibližně stejné oblasti listů. Charakteristické prvky stohu obrazů představují především listové žíly. Jsou však špatně odlišitelné od obsahu obrazu kvůli omezenému kontrastu i barevnému způsobu zobrazování PAM. Oblasti symptomů stresu vizuálně dominující obsahu se mohou měnit mezi obrázky v jedné sérii. V takové situaci by automatická registrace selhala.
nejoblíbenější, automatické nejmodernější metody jsou založeny na srovnání intenzity obrazu s některými korelačními metrikami (metody založené na intenzitě) nebo se spoléhají na vyhledávání v pevných a pohyblivých obrazech pro korespondenci mezi vybranými obrazovými prvky, jako jsou body, čáry a obrysy (metody založené na vlastnostech) . Žádný z těchto přístupů neumožňuje správnou registraci fluorescenčních obrazů Pam společné ledové rostliny, co bylo ověřeno a ukázáno v příkladech obsažených v doplňkových materiálech (další soubor 1). Výsledky zde uvedené potvrzují, že důvodem neúspěšných automatických registrací je silné zatemnění obrazových oblastí se zachovanými rysy dynamickými změnami obsahu obrazu způsobenými infekcí listové tkáně. Testy populárních metod byly prováděny jak registračním odhadcem v Matlabu, tak v prostředí Fidži .
algoritmus registrace obrazu PAM byl navržen v prostředí Matlab na základě sady kontrolních bodů vybraných ručně odborníkem. Pro nastavení odpovídajících kontrolních bodů v každém snímku byla použita funkce cpselect of Control Point Selection Tool z Image Processing Toolbox. Obrázky byly upravovány ve dvojicích včetně pevného obrazu a jednoho pohyblivého obrazu. První obraz získaný těsně po inokulaci patogenu byl předpokládán jako pevný (referenční) obraz. Prostřednictvím interaktivního bodového mapování může uživatel poukázat nejen na viditelné obrysy nervů, ale také na další charakteristické prvky, jako je bod injekce, místa podél šíření patogenu a nejzřetelnější buňky epidermálního močového měchýře (obr. 3).
kontrolní body vybrané odborníkem. Příklad Y (ne) obrázky fragmentu listu rostliny CAM common ice: pevný (referenční) obraz, b pohyblivý obraz, který má být zarovnán s pevným
několik párů míst kontrolních bodů, rozložených co nejširší po povrchu obrazu listu, postačuje k řádnému zarovnání obrazů stejného listu zhruba považovaného za tuhé těleso. Širší rozložení kontrolních bodů zlepšuje citlivost přizpůsobení obrazu, ale je omezeno pookřovým pookřemením obrazu oříznutým po transformaci zarovnání a možností přesného umístění vybraného bodu na listu listu. Při takovém zarovnání obrazu byla afinní transformace provedena pomocí funkce fitgeotrans obsažené v nástroji Image Processing Toolbox. Tato transformace byla omezena na verzi „podobnosti“ (sestávající pouze z překladu, rotace a podobnosti), protože scéna v fluorometru PAM vypadala jako nakloněná. Pohyblivé obrázky byly přiřazeny k pevnému obrazu pomocí funkce imwarp. Grafické znázornění registračního algoritmu je obsaženo na obr. 4.
blokové schéma afinní a volitelné registrace B-spline aplikované na fluorescenční obrázky PAM. \(\left\) – vektor kontrolních bodů v pevném obrazu, \(\left^{\left (k \right)}\) – vektor kontrolních bodů v k-tém pohyblivém obrazu, \(\left^{{\left ({k^{\prime } } \right)}}\) – vektor kontrolních bodů v k-tém pohyblivém obrazu po registraci B-spline
listy v různých stádiích infekce mohou mít povrch lokálně zvlněný nebo vrásčitý jako v oblasti označené na analyzovaných obrázcích Pam-fluorometru (obr. 5a, b), který tvar může potenciálně ovlivnit správnou analýzu jevu šíření patogenu. To znamená, že metoda afinní registrace založená na geometrické transformaci nemusí být dostatečná k tomu, aby odpovídala fluorescenčním obrazům PAM v některých případech listů se zjevně viditelnou nelineární deformací. Autoři proto navrhují dvoustupňovou registrační metodu, kde afinní rigidní registraci následuje registrace B-spline redukující nelineární deformace.
příklad registrací afinních a B-spline pro obrázek listu C3 common ice plant. a obraz Y(NO) po získání PAM, b obraz po rigidní afinní transformaci se šipkami představujícími interaktivně nastavené vektory posunutí použité ve druhé fázi registrace a c finální formulář po registraci B-spline založené na kontrolním bodě
výběr netuhého registračního typu využívá skutečnosti, že listy obyčejných ledových rostlin představují trochu pružný materiál a malé ohybové síly udržují hladké změny v profilu povrchu listů. Specifičnost této registrační modifikace spočívá v tom, že vektory deformačního pole obrazu musí být uloženy interaktivně. Za tímto účelem byl k algoritmu připojen vyhrazený editor vektorových polí. Pro registraci lokálních a hladkých deformací povrchu listu jako na obr. 5b.
pro druhou fázi registrace byl vybrán algoritmus B-spline Rueckert. Jeho implementace je k dispozici v Matlab Central File Exchange jako Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox.
postup registrace B-spline se skládá ze dvou základních kroků:
-
inicializace mřížky G obrazových bodů rovnoměrně rozložených po povrchu obrazu se všemi vektory deformačního pole nastavenými na nulu a poté výpočet hustého vektorového pole t deformací v mřížce G pomocí kubické B-spline interpolace ručně nastavených vektorů posunu kontrolního bodu \(\left^{\left( k \right)}\). Jak mřížka, tak přidružené transformační pole T jsou poté iterativně vylepšeny ve 4 krocích, aby se zmenšily rozteč uzlů mřížky. Transformaci T připraví funkce point_registration z panelu nástrojů Spline Registration Toolbox.
-
B-spline transformace všech pozic pixelů a bi-kubických interpolací barevných složek v pohyblivém (afinně registrovaném) obrazu \(I_{M}\) podle spline vyhlazeného deformačního pole.
přesnost registrace obrazu
přesnost navrhovaného zarovnání obrazu byla provedena kořenovým středním čtvercem (RMS)na odchylkách N = 15 kontrolních bodů znázorněných na obr. 3. Posunutí každého pevného kontrolního bodu obrazu \(P_{i}\) vyhodnoceného v pohyblivém obrazu pro případ s a bez zarovnání bylo znázorněno na obr. 6 jako vektory \(R_{i} P_{i} = \ Delta r_{i}\) a \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{i}\). Chyby posunu RMS všech kontrolních bodů v jednom obrázku pro oba případy jsou vyjádřeny v Eq. (1) as \(\Delta r_{\text{rms}}\) a \(\Delta q_{\text{rms}}\).
ilustrace hodnocení chyb v afinní registraci obrázků PAM. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrolní bod v pevném obrazu \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—mapování kontrolního bodu \(P_{i}\) v pohyblivém obrazu \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mapování kontrolního bodu \(P_{\text{i}}\) po registraci, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—chyba posunutí kontrolního bodu \(p_{\text{i}}\) po registraci
procento zbytkového posunu \(\delta_{rms}\) po registraci afinního typu lze hodnotit na jeden obrázek podle Eq. (2).
vyhodnocené afinní registrační chyby jsou uvedeny v tabulce 1. Původní posuny \(\Delta q_{\text{rms}}\) v rozmezí od 3,01 do 7,09 mm jsou po registraci ‚podobnosti‘ sníženy na rozsah od 0,45 do 1,71 mm \(\Delta r_{\text{rms}}\) pro testované zařízení C3. Stejné parametry pro CAM plant jsou \(1.90 \ div 5.69\; {\text{mm}}\) pro \(\Delta q_{\text{rms}\) a \(0.41 \ div 1.53\; {\text{mm}}\) pro \(\Delta r_{\text{rms}\). Když je \(\delta_{rms}\) zprůměrován jak pro C3, tak pro Cam obrazovou řadu, rovná se přibližně 21% a 23%. Hodnoty fluorescenčních parametrů Y (NO), Fv / Fm a NPQ získané z obrazů listů ledových rostlin bez registrace jsou získány z nekompatibilních částí listu a nelze je vzít v úvahu (viz další soubor 2).
pro další mapování registrace B-spline je chyba transformace definována dvěma složkami. Prvním z nich je posunutí po registraci \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) znázorněné na obr. 7a, s \(R_{i}\) hodnoceno v Eq. (3) jako těžiště \(\bar{p}\) oblasti \(a_{i}\).
kde \(I_{R} \left (p \right) \in \left\) označuje intenzitu obrazu kontrolního bodu v pixelu p, \(\left| {a_{I} } \right|\) – oblast rozmazané oblasti. Druhá složka chyby je definována poloměrem směrodatné odchylky \(\rho_{i}\) intenzity rozprostřené kolem každého kontrolního bodu \(R_{i}\), jak je popsáno v Eq. (4).
kde \(\left\ / \ cdot \ right\/\) označuje euklidovskou normu vektoru mezi body p a \(\bar{p}\) v rovině obrazu. Rozmazání zarovnaného kontrolního bodu \(R_{i}\) se objevuje v důsledku skutečnosti, že nelineární registrace používá bikubickou interpolaci v mřížce s konečným rozlišením G. tento efekt byl experimentálně měřen provedením dané B-spline transformace v obrazu vytvořeném z bílých kontrolních bodů na černém pozadí. Tabulka 2 obsahuje veličiny \(\Delta q_{i}\) n = 9 příklad vektorů pole posunutí znázorněných na obr. 5b. Veličiny \(\Delta r_{i}\) chyb vektorového mapování po registraci spline se měří mezi požadovanými pevnými kontrolními body \(p_{i}\) a centroidy registrovaných bodů \(R_{i}\) vyhodnocenými v oblasti \(A_{i}\). Všechny testované hodnoty \(\Delta r_{i}\) jsou pod rozlišením pixelů rovným \(50\;\upmu {\text{m}}\) a mohou být opomíjeny-zaokrouhleny na 0. To znamená přesné umístění kontrolních bodů pomocí spline transformace. Směrodatná odchylka \(\rho_{i}\) oblasti rozmazání uvedená v tabulce 2 po zdvojnásobení může být měřítkem rozostření kontrolního bodu. Pak se liší přibližně od \(24\; {\text{to}}\; 63\;\upmu{\text{m}}\), což je ekvivalent rozostření jednoho pixelu. Tato transformace tedy umožňuje lokálně obnovit správný tvar Y (NO) změn ve fluorescenčním obrazu.
vysvětlení chyby v registraci obrazu B-spline obrazů Pam. a nesoulad mapování polohy kontrolního bodu při registraci, B distribuce intenzity obrazu registrovaného kontrolního bodu spline, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrolní bod v pevném obrazu \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—ekvivalent kontrolního bodu \(P_{i}\) v pohyblivém obrazu \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mapování kontrolního bodu \(P_{i}\) po registraci, \(R_{i} P_{i} =\Delta R_{i}\)—chybová míra posunutí mapování kontrolního bodu \(I_{i}\) P_{i}\),\(a_{i}\)—rozmazaná oblast kolem\ (R_{i}\) odpovídající kontrolnímu bodu\ (P_{i}\), \(\rho_{i}\)—poloměr směrodatné odchylky\ (R_ {i}\) rozostření
měření šíření napětí
analýza dat používá speciální editor pro manipulaci se stohem Pam obrazů po jejich registraci. Funkce hlavního editoru umožňuje kreslení dvou úseků řádků pro sběr dat \(L_{1} \;{\text{a}}\;L_{2}\) stejné délky (obr. 8), které lze pozorovat a dostupné na libovolném obrázku ze zásobníku. V uvažovaném experimentu začíná první řádek \(L_{1}\) v místě inokulace \(s_{1}\), Kde je stresový faktor aplikován na listovou tkáň v čase t a měl by být přibližně nastaven ve směru expanze napětí. Druhá přímka \(L_{2}\) je umístěna podél středního okraje, kde byl pozorovaný vliv napětí v čase vždy omezen a fluorescenční parametry vykazují minimální změny. Řádky by měly zcela zapadat do kontextu obrazu.
oblasti měření v y (NO) obrazech obyčejných listů ledových rostlin po zarovnání počítače. Body měření ukazují: (1) mezofyl v místě očkování, (2) mezofyl bez zranění, (3) midrib v blízkosti místa očkování. Měřící čára (L1) je orientována ve směru šíření napětí v mezofylu a přímka (L2) je umístěna podél středové hrany. Linky začínaly v bodech (S1) a (S2)
další možnost bodového měření je možná tam, kde jsou v zorném poli interaktivně umístěny tři malé různé kruhové oblasti o poloměru 10 pixelů (obr. 8). Měly by patřit do oblastí listů s různými fluorescenčními parametry, které se v průběhu času vzorují. Všechny registrované hodnoty pixelů jsou zprůměrovány uvnitř těchto oblastí.