průmyslové anaerobní Clostridium acetobutylicum používá polyketidy k regulaci buněčné diferenciace

bakteriální kmeny a média

C.acetobutylicum ATCC 824 bylo kultivováno v anaerobní komoře (laboratorní produkty Coy) obsahující atmosféru 97% dusíku a 3% vodíku. 2xYTG medium67 obsahovalo 16 g / L tryptonu, 10 g / l kvasnicového extraktu, 5 g / L NaCl a 10 g/L glukózy (není-li uvedeno jinak) s pH upraveným na 5.2 pro kapalná média a 5.8 pro pevná média (rovněž obsahující 15 g / L agaru). Klostridiální růstové médium (CGM)68 obsahovalo 30 g/L glukózy (není-li uvedeno jinak), 6,25 g/L kvasnicového extraktu, 2,5 g/l síranu amonného, 1,25 g/l NaCl, 2,5 g/L asparaginu, 0,95 g/L monobazického fosforečnanu draselného, 0,95 g/L hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/L heptahydrátu síranu hořečnatého, 13 mg/L heptahydrátu síranu manganatého a 13 mg/L heptahydrátu síranu železitého s pH upraveným na 6,4. P2 medium69 obsahoval 80 g/L glukózy (není-li uvedeno jinak), 1 g/l kvasnicového extraktu, 2,2 g/l octanu amonného, 0.5 g / L Hydrogenfosforečnan draselný, 0,5 g / L Hydrogenfosforečnan draselný, 0,2 g / L heptahydrát síranu hořečnatého, 1 mg/L para-aminobenzoová kyselina, 1 mg/L thiamin hydrochlorid, 10 µg/l biotin, 10 mg / L heptahydrát síranu manganatého, 10 mg / L heptahydrát síranu železnatého a 10 mg / l NaCl s pH upraveným na 6,4. Klostridiální bazální médium (CBM)70 obsahovalo 10 g/L glukózy, 0,5 g / L monobazického fosforečnanu draselného, 0,5 g / L hydrogenfosforečnanu draselného, 4 g / L tryptonu, 0.2 g / L heptahydrát síranu hořečnatého, 10 mg / L heptahydrát síranu manganatého, 10 mg / L heptahydrát síranu železnatého, 1 mg/l para-aminobenzoová kyselina, 1 mg/L thiamin hydrochlorid a 2 µg/l biotin s pH upraveným na 6,9. Pro pevné desky CGM bylo přidáno 15 g / L agaru. CBM-S (Používá se pro kapalné sporulační testy) byl identický s CBM s výjimkou 50 g / L byla použita glukóza a 5 g/L CaCO3 byl přidán těsně před inokulací kultur. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) byla pěstována v médiu Luria-Bertani (LB) při 37 °C. U vhodných kmenů Clostridium bylo kultivační médium doplněno erythromycinem (Era; 40 µg / mL pro pevná média, 80 µg / mL pro kapalná média) a/nebo thiamfenikolem (Th; 5 µg / mL pro pevná a kapalná média). Kanamycin (kan; 60 µg / mL) nebo chloramfenikol (Cm; 25 µg/mL) byly přidány do kultivačního média E.coli, jak je uvedeno. Kmeny Clostridium a E. coli byly udržovány jako 20% objemových zásob glycerolu uchovávaných při -80 °C.

plazmidová konstrukce

oligonukleotidy byly poskytnuty integrovanými technologiemi DNA (doplňková Tabulka 5). Pro všechny PCR reakce byla použita Phusion polymeráza (NEB). Pro izolaci genomové DNA z C. acetobutylicum ATCC 824 byla použita metoda alkalické lýzy71. C. acetobutylicum bylo kultivováno přes noc v 2xYTG médiu do stacionární fáze (OD600 > 2,0), V tomto bodě bylo 10 mL kultury centrifugováno při 3500×g po dobu 15 minut (pokojová teplota). Supernatant byl zlikvidován a buněčná peleta byla resuspendována v 5 mL nastaveném pufru (75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Lysozym byl přidán do konečné koncentrace 2 mg / mL a roztok byl jemně promíchán. Směs byla inkubována při 37 °C po dobu 60 minut s jemným mícháním prováděným každých 15 minut. Po inkubační době bylo přidáno 660 µL lyzačního pufru (1 M NaOH, 10% hmotnostních SDS) a roztok byl důkladně promíchán. Proteináza K Byla přidána do konečné koncentrace 0,5 mg / mL a roztok byl inkubován při 55 °C po dobu 1 hodiny. po této inkubační době byl přidán stejný objem fenolu: chloroformu (1: 1)a roztok byl míchán inverzí po dobu 5 minut. Roztok se potom odstředí při 3500×g po dobu 15 minut (pokojová teplota) a horní vodná fáze se pipetováním zlikviduje. Do organické fáze se přidá 3 M octanu sodného (10% v / v v konečném roztoku). K vysrážení genomové DNA byly přidány 2 objemy ethanolu a roztok byl smíchán. Vysrážená genomová DNA byla odebrána pomocí skleněného háčku a promyta 70% ethanolem. Promytá DNA se potom 15 minut suší nad plynným dusíkem, resuspenduje se v nízkém TE pufru (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) a rozpustí se inkubací při 50 °C.

pro konstrukci plazmidu pKO_mazF_mod (který by později sloužil jako šablona pro pKO_pks) byly primery pKON_Fo a pKON_Ro použity k zesílení oblasti 5,0 kb z šablony pko_mazf15. Tento krok byl nutný k odstranění oblasti 677 bp z páteře pKO_mazF, kterou jsme nebyli schopni amplifikovat pomocí PCR. 5,0 kb PCR produkt byl gel purifikován, štěpen na 5′ a 3 ‚ koncích pomocí PshAI, ligován za vzniku pKO_mazF_mod a transformován na E.coli TOP10. Transformační klony byly vyšetřeny purifikovaným testováním plazmidu a Sangerovo sekvenování bylo použito k potvrzení sekvence konečného klonu pKO_mazF_mod. Pro konstrukci plazmidových pKO_pks (pro deleci genu pks z C. acetobutylicum) byla oblast 3,8 kb obsahující colE1, repL, bgaR a mazF amplifikována PCR z pKO_mazF_mod pomocí primerů pKO_F a pKO_R. navíc primery UHR_Fo a UHR_Ro a DHR_Fo a DHR_Ro byly použity k PCR amplifikaci oblastí 1 kb představujících homologní oblasti proti proudu a po proudu (UHR a DHR) lemující Gen pks (UHR a DHR) ca_c3355) od A C. acetobutylicum ATCC 824 genomová dna šablona. Gen rezistence na chloramfenikol/thiamfenikol a konstitutivní promotor (P ptb z C. acetobutylicum) byly PCR amplifikovány z pKO_mazF_mod pomocí primerů CMR_F a CMR_R (oblast 1.1 kb). Tyto čtyři PCR produkty byly ligovány gibsonovou sestavou a transformovány na E. coli TOP10. Transformační klony byly vyšetřeny purifikovaným testováním plazmidu a Sangerovo sekvenování bylo použito k potvrzení sekvence konečného klonu pKO_pks. Pro konstrukci plazmidu pAN315 (nezbytné pro methylaci pKO_pks a pCKO_pks před transformací na C. acetobutylicum), oblast 6,4 kb z plasmidu pAN172 byla amplifikována pomocí primerů pAN1_F a pAN1_R a oblast 1,0 kb obsahující Gen rezistence kanamycinu z vektoru pCOLA_Duet byla amplifikována pomocí primerů KAN_Fo a KAN_Ro. Gelové extrahované PCR produkty byly ligovány gibsonovou sestavou a transformovány na E.coli TOP10. Transformační klony byly promítány purifikovaným testováním plazmidu a Sangerovo sekvenování bylo použito k potvrzení sekvence konečného klonu pAN3. Pro konstrukci plazmidu pCKO_pks (pro expresi genu pks pod konstitutivním promotorem krotonázy z C. acetobutylicum), primery CPKS_Fo a CPKS_Ro byly použity k PCR amplifikaci 5,4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 PKS genu (CA_C3355) s vhodnými převisy pro Gibsonovu montáž. Páteř pwis_empty vector71 (obsahující konstitutivní promotor crt před místem vícenásobného klonování) byla PCR amplifikována pomocí primerů pWIS_F a pWIS_R za vzniku produktu 5.0 kb. Dva gelové purifikované PCR produkty byly ligovány gibsonovou sestavou a transformovány na E.coli TOP10. Transformační klony byly vyšetřeny purifikovaným testováním plazmidu a Sangerovo sekvenování bylo použito k potvrzení sekvence konečného klonu pCKO_pks.

pro konstrukci plazmidu pET24b_pks byl 5,4 kb Gen C. acetobutylicum ATCC 824 PKS (CA_C3355) amplifikován z genomové DNA C.acetobutylicum pomocí primerů PKS_Fo a PKS_Ro. Dvakrát štěpený vektor pET24b (EcoRI / XhoI digestován) byl ligován s dvojnásobně štěpeným produktem pks PCR (EcoRI / XhoI digestován) a ligační produkt byl transformován na E. coli TOP10. Transformační klony byly vyšetřeny purifikovaným testováním plazmidu a Sangerovo sekvenování bylo použito k potvrzení sekvence konečného klonu pET24b_pks.

Elektro-transformace C. acetobutylicum

před transformací na C. acetobutylicum byl Vektor pKO_pks společně transformován s pAN3 na E. coli TOP10 elektroporací. Tento postup umožnil methylaci pKO_pks nezbytných pro překonání nativního restrikčně-modifikačního systému aktivního v C. acetobutylicum 72. Čištění plazmidu e. byla provedena kapalná kultura coli pKO_pks/pAN3 a výsledná směs plazmidu byla použita pro elektroporace C. acetobutylicum pomocí dříve publikované metody72, kterou zde podrobně popisujeme. Pro přípravu elektrokompetentních buněk byla jedna kolonie C. acetobutylicum z desky 2xYTG (starší než 1 týden) šokována teplem při 80 °C po dobu 10 minut a použita k inokulaci 10 mL CGM. Po inkubaci přes noc při 37 °C a dosažení střední exponenciální fáze (od600 0,4-0,9) se k inokulaci 54 mL čerstvého 2xYTG použilo 6 mL kultury. Tato subkultura byla inkubována při 37 °C až do dosažení OD600 1.2 (~5 h), v tomto okamžiku byla subkultura odstředěna při 3500×g po dobu 20 minut (4 °C). Po odstranění supernatantu byla buněčná peleta resuspendována do 20 mL ledově studeného elektroporačního pufru (EPB; 270 mM sacharóza, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4). Resuspendované buňky byly centrifugovány při 3500×g po dobu 10 minut (4 °C), supernatant byl zlikvidován a buněčná peleta byla resuspendována ve 20 mL ledové EPB. Po konečné peletování centrifugací při teplotě 3500×g po dobu 10 minut (4 °C) byl supernatant zlikvidován a peleta byla resuspendována v 2,3 mL ledové EPB. Tato konečná resuspenze byla použita jako zásoba elektrokompetentních buněk. Elektro-transformace byly provedeny prvním smícháním (nad ledem) 500 µL kompetentních buněk a ~20 µL roztoku plazmidové DNA (celkem 1-5 µg), který měl být transformován. Směs se přenese do 0,4 cm elektroporační kyvety a nechá se 15 minut inkubovat na ledu. Elektroporace byly prováděny s následujícími parametry: napětí, 2000 v; kapacita, 25 µF; odpor, nekonečný Ω. Po elektroporaci byly vzorky resuspendovány v 1 mL 2xYTG a přeneseny do zkumavky obsahující 9 mL 2xYTG. Po smíchání inverzí se kultury nechaly regenerovat při 37 °C po dobu 4 h. regenerační kultury se centrifugovaly při 3500×g po dobu 15 minut (pokojová teplota)a supernatant se zlikvidoval. Buněčná peleta byla resuspendována v 500 µL 2xYTG a 100 µL bylo naneseno na pevné 2xYTG destičky doplněné vhodným antibiotikem. Destička byla inkubována při 37 °C po dobu 2-3 dnů a transformační kolonie byly podrobeny ověření založené na PCR.

delece genu pks a genetická komplementace

cílené KO genu pks (ca_c3355) v C. acetobutylicum ATCC 824 bylo dosaženo pomocí dříve publikované metody15. Podrobně bylo 5 µg methylované směsi pKO_pks/pAN3 plazmidu transformováno na C. acetobutylicum pomocí výše popsané metody. Po regeneraci v kapalném 2xYTG médiu po dobu 4 h byly buněčné pelety odebrány centrifugací (3500×g, 15 min, pokojová teplota), resuspendovány v 0,5 mL čerstvé kapaliny 2xYTG a 100 µL resuspendované buněčné kultury bylo naneseno na pevné 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 mM β-laktózové destičky. Za těchto podmínek pokovování, očekává se, že přežijí pouze buňky, které prošly požadovanou homologní rekombinační událostí s dvojitým křížením. Kontraselekce vektorové páteře je zajištěna promotorem indukovatelným laktózou (P bgaL), který pohání toxinový Gen mazF na páteři vektoru pKO_pks. Po tomto postupu pokovování bylo pozorováno zhruba 10 kolonií na 2xYTG + 5 µg / mL TH + 40 mM β-laktózových destičkách. Z těchto 10 kolonií byly čtyři dvakrát obnoveny a podrobeny ověření PCR kolonie. Jako základ ověření PCR kolonie byly použity čtyři sady primerů, jak je podrobně popsáno v doplňkovém obr. 2.

pro generování genetického komplementačního kmene pks byla provedena elektroporace ∆pks C. acetobutylicum se směsí plazmidu pCKO_pks / pAN3, jak je popsáno výše. Po elektroporaci a regeneraci byly kultury naneseny na pevné médium 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL Era. Po dvojnásobném restreakingu na pevném médiu 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL byly potenciální kolonie ukrývající pCKO_pks vyšetřeny pomocí kolonie PCR pomocí primerů pCKO_F a pCKO_R.

LC-HRMS metabolomická analýza

pro necílené metabolomické srovnání divokého typu a ∆pks C. acetobutylicum byly jednotlivé kolonie každého kmene šokovány teplem při teplotě 80 °C po dobu 10 minut a použity k inokulaci 10 mL kapalného CGM (30 g / l glukózy). Po inkubaci přes noc (stagnující) až do dosažení OD600 ~1,0 byly tyto kultury použity k inokulaci 10 mL kapalného CGM (80 g/l glukózy) 10% inokula pro subkulturu. Po ~5 h (OD600 ~1.0) stagnujícího růstu byly subkultury použity k inokulaci kvadruplicitních kvašení baňky (70 mL CGM, 80 g/l glukóza + 5 µL Antifoam 204, 3% inokulum) míchaných pomocí magnetických míchacích tyčí. Uhličitan vápenatý (6 g / L) byl doplněn do fermentačního média pro pufrování pH. Veškerá kultivace byla provedena při teplotě 37 °C. přibližně 5 µg / mL Th bylo zahrnuto do všech kultur ∆pks s výjimkou konečné fermentační kultury, protože je známo, že některá antibiotika narušují fermentační fáze ABE. Vzorky fermentačního vývaru (1 mL) z každé replikace byly odebrány během časné stacionární fáze a extrahovány 3 mL chloroformového methanolu 2:1. Směsi byly vířeny, odděleny centrifugací (2700×g, 10 min) a spodní vrstva bohatá na chloroform byla přenesena do skleněné lahvičky. Tyto organické extrakty byly vysušeny plynným dusíkem, resuspendovány ve 100 µL methanolu a 10 µL bylo injikováno na přístroj Agilent Technologies 6520 s přesnou hmotností QTOF LC-MS vybavený sloupcem Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Byl použit lineární gradient 2-98% CH3CN (obj./obj.) po dobu 40 minut v H2O s 0,1% kyselinou mravenčí (obj./obj.) při průtoku 0,5 mL/min. Metabolomická analytická platforma XCMS16 (Scripps Research Institute) byla použita k porovnání metabolomů kmenů divokého typu a PKS na základě čtyřnásobných údajů LC-HRMS. MS vrcholy jedinečné pro ∆pks (obr. 1a) byly identifikovány pomocí následujících parametrů: hodnota p < 0,01, změna násobku > 10,0, maximální intenzita > 5000.

bioreaktorové fermentace

pro porovnání Abe fermentačních profilů divokého typu a ∆pks C. acetobutylicum, bioreaktorové fermentace byly prováděny v BIOREAKTORECH DASGIP (nádoby 4 × GPI 100, Bioblokový systém DASGIP) s pracovními objemy 500 ml. Jednodenní kultury (10 mL CGM, 30 g/l glukózy, stagnující, 34 °C) Inokulované teplem šokovanými jednotlivými koloniemi C. acetobutylicum byly kultivovány až do dosažení OD600 ~1. Poté bylo použito 10% inokulum pro zahájení subkultury (30 mL P2 média, 80 g/l glukózy, stagnující, 34 °C) a subkultura byla inkubována až do dosažení OD600 ~1. 30 mL subkultury byly poté asepticky přeneseny do jednotlivých bioreaktorů dasgip předem naplněných 500 mL P2 médiem (80 g / l glukózy, 100 µL Antifoam 204, 34 °C). Kvašení bylo povoleno pokračovat po dobu 54 hodin s pravidelným vzorkováním pro měření optické hustoty, analýza fermentačního produktu, a kvantifikace sloučenin 1, 2, a 3. Teplota byla udržována na 34 °C po celou dobu fermentace, míchání bylo zajištěno mícháním při 200 ot / min a pH bylo udržováno nad 5,0 automatickým přidáním 3 M NH4OH. Pro udržení anaerobních podmínek byl plynný dusík bez kyslíku po dobu trvání fermentace sparkován rychlostí 2 sL/h. Pro kvantifikaci sloučenin 1, 2 a 3 se 1 mL fermentačního vývaru smísí s 3 mL ethylacetátu, víří, oddělí se centrifugací (2700×g, 10 min, pokojová teplota) a horní organická vrstva se izoluje. Organická vrstva byla sušena rotačním odpařováním, resuspendována v 200 µL methanolu a 20 µL bylo vstříknuto na přístroj Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (s DAD) opatřený kolonou Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Byl použit lineární gradient 2-98% CH3CN (obj./obj.) po dobu 40 minut v H2O s 0,1% kyselinou mravenčí (obj./obj.) při průtoku 0,5 mL/min. Sloučeniny 1, 2 a 3 byly identifikovány absorpcí UV (240 nm), jak je prokázáno na obr. 1b, a byly kvantifikovány integrovanou špičkovou oblastí (absorbance při 240 nm).

fermentační analytické postupy

spektrofotometr byl použit ke stanovení hustoty buněk měřením optické hustoty při 600 nm (OD600). K analýze C byl použit systém Shimadzu Prominence UFLC vybavený sloupcem Biorad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm). acetobutylicum fermentační vývar pro koncentraci glukózy a fermentačních produktů (acetát, butyrát, laktát,aceton, butanol a ethanol). Vzorky fermentačního vývaru (1 mL) byly nejprve peletovány centrifugací při 10 000×g po dobu 3 minut, poté následovala filtrace supernatantu pomocí 0,22 mikronového PVDF stříkačkového filtru. Vzorky filtrovaného supernatantu (20 µL) byly injikovány do systému UFLC s pohyblivou fází 0,01 N kyseliny sírové tekoucí při 0,7 mL / min, při teplotě kolony 35 °C a byly chromatografovány po dobu 35 minut. Analyty byly detekovány pomocí detektoru indexu lomu (používaného ke kvantifikaci koncentrací glukózy, acetátu, laktátu, butanolu a ethanolu) a detektoru diodového pole (používaného ke kvantifikaci koncentrací butyrátu (208 nm) a acetonu (265 nm)).

izolace RNA a analýza RNA-Seq

vzorky (10 mL) fermentačního vývaru byly odebrány v biologickém trojím provedení z bioreaktorových fermentací divokého typu a ∆pks C.acetobutylicum 26 h po inokulaci. Vzorky byly odstředěny (4000×g, 10 min, 4 °C) a pelety byly resuspendovány a uloženy v činidle RNAprotect Cell (Qiagen). Celková RNA byla extrahována pomocí Rneasy Mini Kit (Qiagen) podle pokynů výrobce. Léčba Dnázou ve sloupci byla provedena za použití Dnázy I (bez Rnázy) (NEB). Kontrola kvality RNA, konstrukce knihovny a sekvenování knihovny byly provedeny laboratoří funkční genomiky University of California-Berkeley QB3 a Vincent J. Coates Genomic Sequencing Laboratory. Kvalita a koncentrace RNA byla hodnocena pomocí nanočipu na Bioanalyzátoru Agilent 2100. Bakteriální 16S a 23S rRNA byla odstraněna pomocí RiboZero Kit (Illumina). Výsledná messengerová RNA (mRNA) byla převedena na knihovnu RNA-Seq pomocí stavebnice knihovny mRNA-Seq (Illumina). Sekvenování knihovny RNA bylo provedeno na Illumina HiSeq4000 s 50 bp jedním koncem čtení. Sekvenační čtení (50 bp) byly zpracovány a mapovány na genom C. acetobutylicum ATCC 824 (NCBI accession NC_003030.1 a NC_001988.2) pomocí CLC Genomics Workbench 9.0 s výchozími parametry. Čtení, která nebyla jedinečně zarovnána s genomem, byla vyřazena. Rozdíly v genové expresi mezi divokým typem a ∆pks C. acetobutylicum byly vypočteny pomocí stejného softwaru. Geny byly považovány za diferencovaně exprimované s hodnotou P < 0,003 (na základě nepárového t-testu, n = 3)a / normalizovaná změna násobku / > 2,0. Falešné korekce rychlosti zjišťování p-hodnot byly vypočteny v CLC Genomics Workbench 9.0 pomocí publikované metody73. Výsledky analýzy RNA-Seq jsou uvedeny v doplňkových údajích 1. Řetězcová analýza30 byla provedena ke stanovení domnělých interakcí protein-protein mezi diferencovaně exprimovanými geny odhalenými analýzou RNA-Seq.

srovnávací testy fenotypů

byly provedeny s menšími modifikacemi74. Vzorky byly odebrány z biologických trojitých tekutých kultur po 5 dnech inkubace (30 mL CBM-S, 37 °C). Vzorky 20 µL byly šokovány teplem (80 °C, 10 min), ředění (101-106) bylo pozorováno na deskách 2xYTG a kolonie byly vyjmenovány po 30 hodinách inkubace (37 °C) pro výpočet počtu tepelně odolných jednotek tvořících kolonie (cfu/mL). Pro chemickou komplementaci ∆pks v kapalném sporulačním testu byla v době inokulace doplněna purifikovaná klostrienóza (konečná koncentrace 3,5 µM) v kulturách CBM-S ∆pks C.acetobutylicum. Vzhledem k tomu, že sloučenina 3 byla přidána jako koncentrovaný roztok v methanolu, byl ke kontrole tohoto účinku přidán ekvivalentní objem methanolu (60 µL) do všech ostatních kapalných sporulačních testovacích kultur (divoký typ a nekomplementované ∆pks).

pro solidní sporulační testy byla použita dříve popsaná metoda75 s některými modifikacemi. Podrobně byly jednotlivé kolonie šokovány teplem (80 °C, 10 min) kultivovány v kapalném médiu (10 mL CGM, 37 °C) po dobu 24 hodin. kultury byly zředěny faktorem 106 a pokoveny na pevném CBM. Odběr vzorků byl proveden 1, 2, 3, 4 a 6 dní po počátečním pokovování. Pro odběr vzorků byly tři jednotlivé kolonie kombinovány a důkladně resuspendovány v 60 µL kapalného CGM. 20 µL resuspendované směsi kolonií bylo poté šokováno teplem (80 °C, 10 min), ředění (101-106) bylo spatřeno na deskách 2xYTG a kolonie byly vyjmenovány po 30 hodinách inkubace (37 °C) pro výpočet počtu tepelně odolných jednotek tvořících kolonie (cfu/kolonie). Všechny vzorky byly provedeny jako biologické triplikáty.

testy akumulace granulózy byly provedeny barvením jodem53. Kapalné kultury střední log fáze (OD600 ~0,6) (P2, 37 °C) byly naneseny na pevné médium 2xYTG se zvýšenou hladinou glukózy (50 g / L), aby se umožnila produkce granulózy. Destičky byly inkubovány při 30 °C po dobu 4 dnů, v tomto okamžiku byly obarveny vystavením lože jodových krystalů po dobu 10 minut. Destičky se pak nechaly destinovat po dobu 10 minut před zobrazením. Pro chemickou komplementaci ∆pks v testu akumulace granulózy byla purifikovaná klostrienóza (konečná koncentrace destiček 4,0 µM) vložena do pevných 2xYTG desek před pokovením kultury ∆pks. Vzhledem k tomu, že klostrienóza byla přidána do 2xYTG destiček jako koncentrovaný roztok v methanolu (smíchaný do roztaveného média před tuhnutím), byl ekvivalentní objem methanolu (6 µL) přidán ke všem ostatním 2xYTG destičkám použitým v testech akumulace granulózy pro kontrolu tohoto účinku.

jednotlivé kolonie C. acetobutylicum Kultivované na CBM deskách po dobu 48 h (37 °C)byly prohlíženy a zobrazovány pomocí pitevního mikroskopu Leica MZ16 F vybaveného kamerou Leica DFC300 FX.

byly provedeny testy šíření oleje, jak bylo dříve popsáno76, 77, 78. Podrobně byla skleněná kádinka o objemu 400 mL (vnitřní průměr 7,5 cm) naplněna 300 mL vody a byla přidána kapička 10 µL parafinového lampového oleje a ponechána rozprostřít se do tenkého filmu na vodní hladině po dobu 5 minut (průměr~25 mm). Roztoky surfaktinu, purifikované klostrienózy a kontroly pufru fosforečnanu draselného byly připraveny při indikovaném pH a koncentraci (připravené v 10 mM pufru fosforečnanu draselného). Do středu olejového filmu bylo opatrně přidáno asi 10 µL vzorku a byl pozorován účinek na olejový film. Očekává se, že vzorky s aktivitou povrchově aktivní látky vytvoří stabilní kruhové clearingové zóny v olejovém filmu, přičemž silnější aktivita povrchově aktivní látky odpovídá větším clearingovým zónám(nebo úplné disperzi olejového filmu pro aktivitu velmi vysoké povrchově aktivní látky). Testy pádu byly provedeny77, 79, 80. Kruhové mikrovlnky (vnitřní průměr 8 mm) uvnitř polystyrenového víka 96-mikrovlnné desky (12,7 × 8,5 cm) byly potaženy tenkou vrstvou parafínového lampového oleje přidáním 2,0 µL parafínového lampového oleje do každé jamky a umožněním rovnoměrného šíření kapičky přes mikrovlnku po dobu 1 hodiny. Vzorky surfaktinu, purifikované klostrienózy a kontroly fosforečnanu draselného byly připraveny jako pro testy šíření oleje. Přibližně 5 µL vzorku bylo pečlivě přidáno do středu mikrovlnky. Po 5 minutách byl pozorován tvar a stupeň šíření kapičky. Zatímco se očekává, že kontroly pufru vytvoří stabilní kuličky na povrchu mikrovln, očekává se, že vzorky obsahující povrchově aktivní látku se zhroutí a rozšíří po povrchu mikrovln, s účinnější aktivitou povrchově aktivní látky odpovídající vyššímu stupni šíření kapiček.

purifikace a in vitro analýza proteinu PKS

k čištění proteinu PKS značeného His6 pro analýzu in vitro byl pET24b_pks transformován na E. coli BAP1. Jedna kolonie byla inokulována do 10 mL LB + 50 µg / mL kanamycinu (Kan) pro noční růst při 37 °C. k inokulaci 700 mL LB + 50 µg/mL Kan bylo použito asi 7 mL noční kultury a kultura byla protřepávána při 240 ot / min a 37 °C, dokud nedosáhla OD600 0,5. Po zmrazení kultury po dobu 10 minut byl přidán isopropyl thio-β-d-galaktosid (IPTG)ke konečné koncentraci 0.1 mM k indukci exprese proteinu a kultura byla inkubována při 16 °C po dobu 16 h. buňky byly sklizeny centrifugací (5500×g, 4 °C, 20 min), resuspendovány v 25 mL lyzačního pufru (25 mM HEPES, pH 8,0, 0,5 m NaCl, 5 mM imidazol) a lyzovány homogenizací na ledu. Zbytky buněk byly odstraněny centrifugací (17,700×g, 4 °C, 60 min) a k supernatantu (2 mL/l kultura) byla přidána agarózová pryskyřice Ni-NTA. Směs byla nutátována při 4 °C po dobu 1 h, naložena do kolony gravitačního toku a protein PKS byl eluován se zvyšujícími se koncentracemi imidazolu v pufru A (20 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Purifikovaný protein PKS byl koncentrován a pufr vyměněn za pufr a + 10% glycerolu pomocí odstředivého koncentrátoru Vivaspin. Alikvoty purifikovaného proteinu PKS byly alikvotovány a bleskově zmrazeny v kapalném dusíku. Přibližný výtěžek proteinu byl 5 mg / L (203 kDa).

a PKS loading assay with 14C-značený substrát container, in the total volume of 15 µL, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM CoA, kyselina 2-14C-malonová (0,1 µCi), 10 µM MatB, 17 µM PKS a 50 mM HEPES, pH 8,0. Po 2 hodinách inkubace při 25 °C byly vzorky uhaseny přidáním stejného objemu 1× SDS vzorkového pufru. Po analýze stránky SDS pomocí 4-15% gelu TGX (kritérium) byl gel sušen po dobu 2 h při 50 °C a vystaven na obrazovce skladování fosforu (20 × 25 cm; molekulární dynamika) po dobu 5 dnů. Radioaktivně značený protein byl zobrazen na fosforimageru Typhoon 9400 (režim ukládání fosforu, rozlišení 50 µm; Amersham Biosciences).

pro in vitro testy produktu (50 µL) proteinu PKS bylo 8 µM PKS inkubováno s malonyl-CoA (2 mM) ve fosfátovém pufru (100 mM, pH 7,0) při pokojové teplotě po dobu 2 h za vzniku sloučeniny 4, identifikované srovnáním s chemickým standardem. K testu byl přidán NADPH (2 mM) za vzniku sloučenin 5 a 6, které byly identifikovány ve srovnání s chemickými standardy. Po inkubaci byly testovací směsi dvakrát extrahovány 100 µL 99% ethylacetátu/1% kyseliny octové (v / v). Organické extrakty byly vysušeny a resuspendovány ve 100 µL methanolu a 10 µL bylo injikováno na přístroj Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (s DAD) opatřený kolonou Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Byl použit lineární gradient 2-98% CH3CN (obj./obj.) po dobu 40 minut v H2O s 0,1% kyselinou mravenčí (obj./obj.) při průtoku 0,5 mL/min. LC-HRMS analýza extraktů z testu byla provedena na přístroji Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS vybaveném sloupcem Agilent Eclipse Plus C18 (4 .6 × 100 mm) za použití stejného gradientu rozpouštědla a průtoku popsaného výše.

dostupnost dat

data RNA-seq generovaná v této studii byla uložena v ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) pod přístupovým číslem E-MTAB-6019. Všechny ostatní relevantní údaje jsou k dispozici od autorů na vyžádání.