zatím v naší sérii plazmidů 101 jsme se propracovali mapou plazmidů: rezistence vůči antibiotikům, původ replikace a tak dále. Až do tohoto okamžiku můžeme replikovat náš plazmid a ujistit se, že ho buňky udržují; dalším krokem je získání plazmidu k vyjádření našeho genu zájmu. Zadejte promotor-prvek zodpovědný za zahájení transkripce vaší vložky do RNA.
v praxi termín“ promotor “ popisuje kombinaci promotoru (vazebného místa RNA polymerázy) a operátorů (prvků odezvy). Promotory jsou dlouhé asi 100 až 1000 párů bází a nacházejí se před jejich cílovými geny. Sekvence promotorové oblasti řídí vazbu RNA polymerázy a transkripčních faktorů, proto promotory hrají velkou roli při určování, kde a kdy bude váš Gen zájmu vyjádřen.
RNA polymeráza(y)
RNA je transkribována z DNA pomocí RNA polymerázy (RNAP). U bakterií se to provádí jediným enzymem; eukaryoty však mají muliplové polymerázy, z nichž každá je zodpovědná za specifickou podmnožinu RNA. Pro získání této specifičnosti může eukaryotický RNAP rozpoznat a vázat se na specifické promotorové prvky. To znamená, že promotor přítomný ve vaší plazmidové páteři musí být kompatibilní s typem RNA, který je třeba vytvořit: pokud chcete mRNA (pro genovou expresi), musíte použít promotor RNAP II, zatímco malé RNA (jako je shRNA)jsou transkribovány z promotorů RNAP III. Tento příspěvek obsahuje promotory pro obecnou transkripci RNAP II a RNAP III; použití virových ltr jako promotorů RNAP II se však běžně používá v lentivirových a retrovirových konstrukcích a budeme o nich diskutovat v budoucím příspěvku na částech virových vektorů.
specificita promotoru
kromě výběru promotoru na základě typu transkriptu RNA se musíte také ujistit, že váš plasmid má promotor vhodný pro práci v hostitelském organismu. Protože transkripční stroje se liší mezi typy buněk nebo organismy, promotory musí být podobně variabilní. Bakteriální promotory pracují pouze v prokaryotických buňkách a obvykle pouze ve stejných nebo blízce příbuzných druzích, ze kterých byly odvozeny. Podobně různé typy eukaryotických buněk (savci, kvasinky, rostliny atd.) Obecně řečeno, promotory v bakteriích jsou méně rozmanité a složité a mají méně částí než v eukaryotických buňkách. Někteří promotéři jsou konstitutivně aktivní a po celou dobu, zatímco jiní jsou pečlivěji kontrolováni. Regulované promotory mohou působit pouze v určitých tkáních nebo v určitých obdobích vývoje nebo mohou existovat způsoby, jak je zapnout nebo vypnout chemickou látkou, teplem nebo světlem. V buňce jsou samotné promotory řízeny ještě dalšími regulačními faktory: zesilovači, hraničními prvky, izolátory a tlumiči; může však dojít k určité „netěsnosti“ transkripce. To obvykle není velký problém pro buňky, ale může to zmást výsledky výzkumu nebo dokonce zabít vaše buňky, pokud je váš Gen zájmu toxický. V boji proti tomu vědci vytvořili syntetické promotory, které obvykle obsahují nějakou kombinaci jiných promotorových prvků, a mají tendenci být přísněji regulovány.
společné promotory pro eukaryoty a prokaryoty
níže jsme zahrnuli dvě referenční tabulky uvádějící některé z nejběžnějších bakteriálních a savčích promotorů. Tyto seznamy nejsou v žádném případě vyčerpávající, ale mělo by to být dobré místo, kde začít, když se snažíte vybrat perfektního promotéra!
eukaryotické promotory
| promotor | primárně používaný pro | přepis RNA | popis | výraz | další úvahy |
| CMV | Obecná exprese | mRNA | silný promotor exprese savců z lidského cytomegaloviru | konstitutivní | může obsahovat oblast zesilovače. Může být umlčen v některých typech buněk. |
| EF1a | Obecná exprese | mRNA | silná exprese savců z lidského elongačního faktoru 1 alfa | konstitutivní | má tendenci dávat konzistentní expresi bez ohledu na typ buňky nebo fyziologii. |
| SV40 | Obecná exprese | mRNA | promotor exprese savců z vakuolujícího viru opic 40 | konstitutivní | může zahrnovat enhancer. |
| PGK1 (člověk nebo myš) | Obecná exprese | mRNA | promotor savců z genu fosfoglycerát kinázy. | konstitutivní | rozšířená exprese, ale může se lišit podle typu buňky. Má tendenci odolávat regulaci promotoru v důsledku methylace nebo deacetylace. |
| Ubc | Obecná exprese | mRNA | savčí promotor z lidského genu ubiquitin C | konstitutivní | jak název napovídá, tento promotor je všudypřítomný. |
| lidský beta aktin | Obecná exprese | mRNA | savčí promotor z beta aktinového genu | konstitutivní | všudypřítomný. Kuřecí verze se běžně používá v promotorových hybridech. |
| CAG | Obecná exprese | mRNA | silný hybridní promotor savců | konstitutivní | obsahuje CMV enhancer, kuřecí beta-aktinový promotor a králičí beta-globinový Spojkový akceptor. |
| TRE | obecný výraz | mRNA | promotor prvku tetracyklinové odpovědi | indukovaný Tetracylinem nebo jeho deriváty. | obvykle obsahuje minimální promotor s nízkou bazální aktivitou a několik tetracyklinových operátorů. Transkripci lze zapnout nebo vypnout v závislosti na tom, jaký transaktivátor tet se používá. |
| UAS | Obecná exprese | mRNA | Drosophila promotor conaining gal4 vazebných míst | specifické | vyžaduje přítomnost gal4 genu pro aktivaci promotoru. |
| Ac5 | Obecná exprese | mRNA | silný promotor hmyzu z genu Drosophila Actin 5c | konstitutivní | běžně používaný v expresních systémech pro Drosophilu. |
| Polyhedrin | Obecná exprese | mRNA | silný promotor hmyzu z baculoviru | konstitutivní | běžně používaný v expresních systémech pro hmyzí buňky. |
| CaMKIIa | genová exprese pro optogenetiku | mRNA | Ca2 + /calmodulin-dependentní promotor proteinkinázy II | specifický | používaný pro expresi neuronů/CNS. Modulováno vápníkem a kalmodulinem. |
| GAL1, 10 | obecný výraz | mRNA | kvasinky sousedící, divergentně transkribované promotory | indukované galaktózou; represivní glukózou | lze použít samostatně nebo společně. Regulováno GAL4 a GAL 80. |
| TEF1 | Obecná exprese | mRNA | promotor elongačního faktoru transkripce kvasinek | konstitutivní | analogický promotoru EF1a savců. |
| GDS | Obecná exprese | mRNA | silný promotor exprese kvasinek z glyceraldehyd-3-fosfágdehydrogenázy | konstitutivní | velmi silný, nazývaný také TDH3 nebo GAPDH. |
| ADH1 | Obecná exprese | mRNA | promotor kvasinek pro alkoholdehydrogenázu i | potlačený ethanolem | celovečerní verze je silná s vysokou expresí. Zkrácené promotory jsou konstitutivní s nižší expresí. |
| CaMV35S | Obecná exprese | mRNA | silný rostlinný promotor z viru mozaiky květáku | konstitutivní | aktivní v dvouděložných tělískách, méně aktivní v monokotech, s určitou aktivitou v živočišných buňkách. |
| Ubi | Obecná exprese | mRNA | promotor rostlin z kukuřičného ubichitinového genu | konstitutivní | dává rostlinám vysokou expresi. |
| H1 | malá exprese RNA | shRNA | z promotoru RNA lidské polymerázy III | konstitutivní | může mít mírně nižší expresi než U6. Může mít lepší expresi v neuronálních buňkách. |
| U6 | malá RNA exprese | shRNA | z lidského U6 malého jaderného promotoru | konstitutivní | myší U6 se také používá, ale může být méně účinná. |
prokaryotické promotory
| promotor | primárně používaný pro | popis | výraz | další úvahy |
| T7 | in vitro transkripce / obecná exprese | promotor z bakteriofága T7 | konstitutivní, ale vyžaduje T7 RNA polymerázu. | při použití pro in vitro transkripci promotor řídí buď sense nebo antisense transkript v závislosti na jeho orientaci na váš gen. |
| T7lac | vysoké hladiny genové exprese | promotor z bakteriofága T7 plus operátory lac | zanedbatelná bazální exprese, pokud není indukována. Vyžaduje T7 RNA polymerázu, která je také řízena operátorem lac. Může být vyvolán IPTG. | běžně se vyskytuje v pet vektorech. Velmi přísně regulované operátory lac. Dobré pro modulaci genové exprese prostřednictvím různých koncentrací induktorů. |
| Sp6 | in vitro transkripce / obecná exprese | promotor z bakteriofága Sp6 | konstitutivní, ale vyžaduje SP6 RNA polymerázu. | SP6 polymeráza má vysokou procesivitu. Při použití pro in vitro transkripci, promotor řídí buď sense nebo antisense transkript v závislosti na jeho orientaci na váš gen. |
| araBAD | obecný výraz | promotor metabolického operonu arabinózy | indukovaný arabinózou a potlačenou katabolitovou represí v přítomnosti glukózy nebo kompetitivní vazbou antiinduktoru fukosy | slabší. Běžně se vyskytuje ve vektorech pBAD. Dobré pro rychlou regulaci a nízkou bazální expresi; nicméně, není vhodný pro modulaci genové exprese prostřednictvím různých koncentrací induktorů. |
| trp | vysoké hladiny genové exprese | promotor z e. coli tryptofan operon | represivní | se vypne s vysokou hladinou buněčného tryptofanu. |
| lac | Obecná exprese | promotor z Lac operonu | konstitutivní v nepřítomnosti lac represoru (lacI nebo lacIq). Může být indukován IPTG nebo laktózou. | děravý promotor s poněkud slabým výrazem. mutace lacIq zvyšuje expresi represoru 10x, čímž zpřísňuje regulaci promotoru lac. Dobré pro modulaci genové exprese prostřednictvím různých koncentrací induktorů. |
| Ptac | obecný výraz | hybridní promotor lac a trp | regulovaný jako promotor lac | obsahuje -35 oblastí z trpB a -10 oblastí z lac. Velmi přísná regulace. Dobré pro modulaci genové exprese prostřednictvím různých koncentrací induktorů. Obecně lepší výraz než lac sám. |
| pL | vysoké hladiny genové exprese | promotor z bakteriofága lambda | může být regulovatelný teplotou | často spárován s represorem cI857 citlivým na teplotu. |
| T3 | in vitro transkripce / obecná exprese | promotor z bakteriofága T3 | konstitutivní, ale vyžaduje T3 RNA polymerázu | při použití pro in vitro transkripci promotor řídí transkripci sense nebo antisense v závislosti na jeho orientaci na váš Gen |
ačkoli je tento seznam skvělým místem pro začátek, výše uvedené tabulky se neponořují do tkání nebo vývojově specifických promotorů dostupných vědcům. Plazmidy se často používají k terapeutickým účelům a v těchto případech je důležité identifikovat správné promotory specifické pro tkáň, jak je popsáno výzkumníky na NIH zde.
poznámka: a. Max Juchheim přispěl k napsání tohoto článku.