Přehlednost

3-dimenzionální snímek pořízený technikou CLARITY ukazující 1 milimetrový plátek hippocampu myši. Různé barvy představují proteiny obarvené fluorescenčními protilátkami. Excitační neurony jsou označeny zeleně, inhibiční neurony červeně a astrocyty modře.

proces aplikace zobrazení jasnosti začíná posmrtným vzorkem tkáně. Dále musí být použita řada chemických ošetření, aby se dosáhlo průhlednosti, při které se odstraní obsah lipidů ve vzorku, zatímco téměř všechny původní proteiny a nukleové kyseliny jsou ponechány na svém místě. Účelem je učinit tkáň průhlednou a tak přístupnou podrobnému mikroskopickému zkoumání jejích základních funkčních částí (které jsou převážně proteiny a nukleové kyseliny). Aby toho bylo dosaženo, musí být již existující proteinová struktura umístěna do průhledného lešení, které ji zachovává, zatímco lipidové složky jsou odstraněny. Toto „lešení“ je tvořeno hydrogelovými monomery, jako je akrylamid. Přidání molekul, jako je formaldehyd, paraformaldehyd nebo glutaraldehyd, může usnadnit připojení lešení k proteinům a nukleovým kyselinám, které mají být zachovány, a přidání tepla je nezbytné pro stanovení skutečných vazeb mezi buněčnými složkami a akrylamidem.

jakmile je tento krok dokončen, proteinové a nukleové složky buněk cílové tkáně jsou pevně drženy na svém místě, zatímco lipidové složky zůstávají odděleny. Lipidy jsou pak odstraněny během 1-2 týdnů pasivní difúze v detergentu nebo urychleny elektroforetickými metodami pouze na hodiny až dny. Jak procházejí, lipofilní vlastnosti detergentu mu umožňují vyzvednout a odstranit všechny lipidy, se kterými se na cestě setkáváme. Lipofilní barviva jako DiI jsou odstraněna, existují však lipofilní barviva kompatibilní s jasností, která mohou být fixována na sousední proteiny. Velká většina nelipidových molekul, jako jsou proteiny a DNA, zůstává tímto postupem nedotčena díky akrylamidovému gelu a chemickým vlastnostem zúčastněných molekul.

jak je uvedeno v úvodním článku, tkáň se během tohoto procesu expanduje, ale podle potřeby může být obnovena do svých počátečních rozměrů s konečným krokem inkubace v roztoku shody indexu lomu.

v této fázi procesu byl vzorek plně připraven pro zobrazování. Kontrast pro zobrazování může pocházet z endogenních fluorescenčních molekul, z štítků nukleových kyselin (DNA nebo RNA) nebo z imunostainingu, přičemž se používají protilátky, které se specificky váží na určitou cílovou látku. Kromě toho jsou tyto protilátky označeny fluorescenčními značkami, které jsou klíčem ke konečnému výsledku zobrazování. Standardní konfokální, dvoufotonové nebo světelné zobrazovací metody jsou vhodné pro detekci fluorescence emitované až na stupnici lokalizace proteinů, což má za následek konečné vysoce detailní a trojrozměrné obrazy, které CLARITY vytváří.

poté, co byl vzorek imunostainován pro obraz, je možné odstranit protilátky a znovu aplikovat nové, což umožňuje zobrazení vzorku vícekrát a cílení na více typů proteinů.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.