mikrodelece chromozomu Y u Otce a jeho čtyř neplodných synů

Abstrakt

Mikrodelece Yq jsou spojeny s azoospermií a těžkou oligozoospermií. Obecně jsou muži s delecemi neplodní, a proto se delece nepřenášejí na syny, pokud se neprovádí oplodnění in vitro (IVF) a Intracytoplazmatická injekce spermií (ICSI). Hlásíme neobvyklou rodinu charakterizovanou více členy s neplodností a mikrodelecí Yq. Kompletní reprodukční anamnéza, analýzy spermatu a vzorky krve byly vyvolány od příslušných členů rodiny. Příprava a kvantifikace DNA byla provedena pomocí komerčních souprav. Pro screening bylo použito celkem 27 párů sekvenčně značených lokalit založených sad primerů specifických pro lokusy mikrodeleční oblasti Y. Southern blots using deleted in azoospermia (DAZ) and ribozomal binding motif (RBM) cDNA were then analyzed for confirmation. Proband, bylo zjištěno, že jeho tři bratři a otec byli vymazáni pro DAZ, ale ne RBM. V době analýzy, probandův otec byl azoospermický, zatímco jeho čtyři synové byli buď silně oligozoospermičtí, nebo azoospermičtí. Na rozdíl od svého otce jsou čtyři synové neplodní a nemají potomky, s výjimkou jednoho z nich, který dosáhl dcery až po léčbě neplodnosti IVF/ICSI. Mikrodelece Yq zahrnující Gen DAZ jsou spojeny s variabilní fenotypovou expresí, která může zahrnovat zjevně normální fertilitu.

Úvod

neplodnost se vyskytuje u ~14% párů (Mosher, 1985)a abnormality u mužského partnera se odhadují až v polovině případů (Swerdloff et al ., 1985). Snahy o vyhodnocení příčin azoospermie ukázaly, že po vyloučení tradičně rozpoznatelných příčin (tj. abnormální karyotyp, obstrukce, varikokéla, hormonální defekt atd.), většina případů (50-75%) je nevysvětlitelná a nazývá se idiopatická (Pryor et al., 1997). Nedávno bylo hlášeno, že až 30% mužů s „idiopatickou“ azoospermií má mikrodelece chromozomu Y (Henegariu et al ., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi a kol., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt a kol., 1996; Pryor et al., 1997). Přesně to, jak a zda tyto mikrodelece způsobují azoo / oligozoospermii, je předmětem intenzivního vyšetřování i debaty.

zásadní pro argument, že mikrodelece Y způsobují neplodnost, je pozorování, že plodní muži zřídka projevují mikrodelece Y. Byly hlášeny mikrodelece u čtyř z 200 studovaných plodných mužů (Pryor et al., 1997). Delece u těchto mužů však byly velmi malé a s největší pravděpodobností představovaly nevýznamný polymorfismus. U mužů s normální fertilitou nebyly hlášeny relativně velké delece tohoto druhu spojené s mužskou neplodností. Ačkoli se obecně předpokládá, že tyto delece vznikají de novo a že přenos mikrodelece Y z otce na syna by se neočekával, bylo hlášeno několik vzácných případů přenosu mikrodelece chromozomu Y z otce na jednoho syna (Kobayashi et al., 1994; Stuppia a kol., 1996; Vogt a kol., 1996; Pryor et al., 1997). Vertikální přenos mikrodelece zahrnující odstraněný lokus v azoospermii (DAZ) z otce na jednoho syna však byl hlášen pouze ve třech případech (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Nyní popisujeme čtyřgenerační rodinu, ve které azoospermický otec a jeho čtyři neplodní synové sdílejí zjevně identickou mikrodeleci, která zahrnuje lokus DAZ. Tato rodina představuje první a jedinou zprávu o spontánním vertikálním přenosu delece DAZ na více potomků. Poskytuje důkaz, že jediná mikrodelece Yq může mít za následek různou fenotypovou expresi u různých jedinců. Je klinicky významný v tom, že přítomnost mikrodelece není absolutním markerem neplodnosti a může být spojena se zjevně normální plodností.

materiály a metody

Screening mikrodelece Yq byl proveden rutinně pro mužskou neplodnost pomocí protokolu přezkoumaného a schváleného institucionální revizní Radou College of Physicians & chirurgové, Columbia University. Vzorky byly odebrány pacientům po informovaném souhlasu.

analýza spermatu

výsledky byly analyzovány pomocí kritérií WHO pomocí fázového kontrastního mikroskopu Nikon.

koncentrace sérových hormonů

folikuly stimulující hormon (FSH), luteinizační hormon (LH) a testosteron byly měřeny pomocí pevné fáze, dvoumístného chemiluminiscenčního enzymového imunometrického testu (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Normální rozsahy pro muže jsou FSH <10 mIU / ml; LH <10 mIU / ml; a testosteron 270-1070 ng / dl.

genomová DNA

extrakce genomové DNA z plné krve byla provedena lýzou červených krvinek, následovanou lýzou bílých krvinek a jejich jader. Buněčné proteiny byly odstraněny srážením soli a genomová DNA byla vysrážena isopropanolem pomocí puregene DNA extraction kit (Gentra Systems, Inc . Minneapolis, MN, Spojené státy americké; katalogové číslo. D-5004).

polymerázová řetězová reakce (PCR)

primery byly vyrobeny jako sušené oligonukleotidy na automatizovaném syntezátoru DNA (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Z mapy STS bylo vybráno celkem 27 míst označených specifickou sekvencí chromozomu Y (STS) (Obrázek 1) (Vollrath et al., 1992). Zahrnují tři navrhované lokusy spermatogeneze AZFa, AZFb a AZFc (podle Vogta a kol., 1996) v intervalech 5, 6 a 7. Jako rychlý screeningový protokol byl použit multiplexní systém PCR složený ze dvou až šesti různých párů primerů v celkem šesti multiplexních reakcích (tabulka I). Při každém běhu PCR byla zahrnuta ženská kontrola a normální mužská kontrola. Všechny PCR reakce byly prováděny v polykarbonátových deskách (Techne®) ve stroji MJ Research®. Podmínky PCR byly v podstatě tak, jak bylo dříve popsáno (Henegariu et al ., 1993). Stručně řečeno, při reakci o celkovém objemu 14 µl bylo jako templát použito 50 ng genomové DNA, 1 µl primerového standardního roztoku (směs I nebo II nebo III nebo IV nebo v nebo VI sestávající z 10 pmol na primer), 12 µl „PCR studené směsi“ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l každého dNTP, 5% DMSO, 1× Taq polymerázový reakční pufr bez Mg2+), 1,25 IU Taq DNA polymerázy (Promega) a 1 kapka oleje. Kompletní směsi byly umístěny přímo do termocykleru předehřátého na 94°C. cyklické podmínky pro 27 cyklů byly: 94°C, 30 s (tání); 55°C, 45 s (žíhání); a 72°C, 60 s (prodloužení). Konečný čas prodloužení byl 5 min. Reakční produkty PCR byly poté odděleny na 3% agarózových gelech (Bio-Rad, ultra-čistý stupeň) elektroforézou v TBE pufru. Produkty PCR byly obarveny ethidiumbromidem a vizualizovány vystavením ultrafialovému světlu. STS nevykazující žádné zesílení v multiplexních reakcích byly potvrzeny jednorázovou reakcí PCR s příslušnými pozitivními a negativními kontrolami. STS byl považován za nepřítomný po třech poruchách amplifikace.

Jižní hybridizace

Jižní blotování bylo provedeno podle zavedeného protokolu (Sambrook et al ., 1989). Stručně řečeno, 5 µg genomová DNA byla štěpena HindIII nebo TaqI, proběhla na 0,7% agarózovém gelu ve standardním TBE pufru, přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 32P značenými sondami. DAZ sonda byla čištěná vložka plazmidu (pDP1577) obsahujícího cDNA v plné délce (Reijo et al., 1995). Podobně byla sonda RBM plazmidovou vložkou klonu RBM cDNA (MK5) (Ma et al., 1993).

stanovení otcovství

otcovství všech čtyř synů bylo potvrzeno prokázáním očekávané segregace čtyř vysoce polymorfních autosomálních markerů (Weber a Květen, 1989). Jednalo se o D21S156, D21S270, D13S132 a D13S159 s heterozygozitami 0, 83, 0, 86, 0, 84 a 0, 90.

fluorescenční in-situ hybridizace (ryby)

ryby pro DAZ byla provedena s Cosmid 63C9 (Saxena et al ., 1996), za použití zavedených metod (Yu et al., 1996).

výsledky

proband (jednotlivec III 8 na obrázku 2) a jeho manželka (III-9) představili reprodukční-Endokrinologicko-neplodnou kliniku v Columbia-Presbyterian Medical Center se stížností na primární neplodnost po dobu 3 let. Testy odhalily normální karyotyp a normální hladiny sérových hormonů, zatímco analýzy spermatu prokázaly závažnou oligozoospermii (tabulka II). Mikrodeleční screening pomocí PCR na bázi STS odhalil přítomnost mikrodelece v subintervalu 6D-6F dlouhého ramene chromozomu Y (Obrázek 1). Během diskuse proband uvedl, že jeho dva starší bratři (III-4 a III-6) byli známí jako azoospermičtí a neplodní. Následné zpracování ukázalo, že všichni tři bratři měli zjevně identickou mikrodeleci. Testikulární biopsie provedená na jedné z nich (III-6) prokázala syndrom „pouze Sertoliho buňky“.

nález mikrodelece U Tří neplodných bratrů naznačoval, že jejich otec pravděpodobně nese stejné odstranění. Podrobná studie byla provedena na zbytek rodiny, kteří všichni bydleli v malém městě v Dominikánské republice. Kompletní reprodukční historie byla vyvolána od dospělých členů rodiny. Rodinné vztahy zobrazené v rodokmenu (Obrázek 2) byly potvrzeny ukázáním očekávané segregace několika autosomálních polymorfních markerů (údaje nejsou zobrazeny) pro příslušné členy rodiny (I-1, I-2, II-1, II-8 a II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Neexistovaly žádné důkazy o otcovství. Důkladné cytogenetické studie na příslušných členech rodiny (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 a IV-1) odhalily normální karyotypy. Analýza spermatu byla provedena u sedmi ze 16 mužů a vzorky krve byly získány od většiny členů rodiny.

tabulka II shrnuje výsledky analýzy spermatu a endokrinního zpracování na příslušných rodinných příslušnících. Proband (III-8), jeho otec (II-1) a dva z jeho tří bratrů (III-4, III-6) byli shledáni buď azoospermickými nebo silně oligozoospermickými. Nejstarší bratr probanda (III-1) odmítl analýzu spermatu. Kromě toho bylo zjištěno, že probandův strýc (II-8) má azoospermii a zvýšený FSH s nízkým obsahem testosteronu. Jak je znázorněno na obrázku 1, proband, bylo zjištěno, že jeho otec a tři bratři mají mikrodeleci Yq analýzou STS PCR. Jižní blotování pomocí sond DAZ (obrázek 3) a RBM (data nejsou zobrazena) potvrdilo, že delece zahrnovala lokus DAZ, ale ne lokus motivu vazby RNA (RBM). Analýza ryb s Daz Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) leukocytů probandova otce (II-1) vykazovaly jednotnou nepřítomnost lokusu DAZ (obrázek 4).

zjištění, že jednotlivec II-8 v rodokmenu byl azoospermický, ale neměl mikrodeleci, bylo překvapením. Lokus DAZ u tohoto jedince byl dále testován Jižní analýzou pomocí DAZ cDNA a jiného restrikčního enzymu (TaqI). Neprokázala žádnou abnormalitu lokusu DAZ. Kromě toho ryby s Daz Cosmid 63C9 vykazovaly normální intenzitu (údaje nejsou zobrazeny).

proband (III-8) a jeho starší bratr (III-6) hledali léčbu neplodnosti. Po rozsáhlém poradenství se rozhodli pro oplodnění in vitro (IVF) a intracytoplazmatickou injekci spermií (ICSI). Proband (III-8) a jeho manželka (III-9) podstoupili dva cykly IVF-ICSI, které nevyvolaly těhotenství sekundární ke špatné odpovědi vaječníků. Probandův bratr (III-6) a jeho manželka (III-7) podstoupili jeden cyklus kontrolované ovariální hyperstimulace a bylo získáno devět oocytů. Jedenáct zralých spermií bylo nalezeno ve třech ejakulátech v den vyhledávání a použito pro ICSI. Oplodnily se tři oocyty, které se následně štěpily a byly přeneseny. Porodila zdravé ženské dítě (IV-2).

diskuse

uvádíme výjimečnou rodinu, ve které azoospermický otec a jeho čtyři neplodní synové sdílejí zjevně identickou mikrodeleci Yq zahrnující lokus DAZ. Zdá se, že de-novo mutace, která vedla k mikrodeleci DAZ, vznikla u probandova otce (II-1). Očekává se, že toto odstranění způsobí azoo/oligozoospermii a mužskou neplodnost, a přesto spontánně počal pět dětí a nevěděl o žádném problému s plodností. Zajímavé však je, že všichni čtyři synové jsou neplodní a jsou buď azoospermičtí, nebo silně oligozoospermičtí.

tato rodina vyvolává několik otázek, pokud jde o souvislost mezi mikrodelecí Yq a neplodností. Nejprve potvrzuje, že vertikální přenos mikrodelece Yq je možný a může vést k následné neplodnosti u mužských potomků. Za druhé, je zřejmé, že stejné odstranění může mít za následek různé fenotypy u různých jedinců. Ačkoli otec (II-1) čtyř chlapců v této rodině byl v době analýzy azoospermický, zplodil své první dítě ve věku 25 let a jeho poslední ve věku 38 let. Tím pádem, měl určitý stupeň plodnosti po velké rozpětí let. Stejně tak mikrodelece chromozomu Y, konkrétně DAZ, nemusí nutně znamenat celoživotní historii azoospermie ani nevylučuje vytvoření velké rodiny. Jeho čtyři synové jsou naopak neplodní a buď azoospermičtí, nebo těžce oligozoospermičtí.

Gen DAZ byl navržen jako faktor azoospermie na chromozomu Y. Tato rodina jasně ukazuje, že zatímco DAZ může mít rozhodující roli ve spermatogenezi, není to nezbytné pro plodnost. Kromě toho může být úplná ztráta klastru genů DAZ spojena s histologickým obrazem „pouze Sertoliho buňky“ a zastavením zrání spermií (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Několik autorů zjistilo špatnou korelaci mezi umístěním mikrodelecí Y (včetně delecí DAZ) s klinickým a histologickým fenotypem pacientů (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Zjištění v této rodině souhlasí s tím, že taková korelace se může ukázat jako docela problematická. Testikulární biopsie probandova bratra (III-6)ukázala obraz „pouze Sertoliho buňky“, zatímco u probandu (III-8 s počtem spermií 0,5×106 / ml) lze jednoznačně očekávat určitý stupeň zrání spermií při biopsii. Kromě toho testikulární biopsie nemusí být reprezentativní pro celé varle, protože může existovat geografická heterogenita pro spermatogenezi jako u jednotlivých III-6, jejichž ejakuláty obsahovaly zralé spermie.

můžeme pouze spekulovat o základech fenotypových rozdílů mezi členy rodiny se stejným odstraněním. Je dobře známo, že identické delece v autosomech mohou mít za následek různé fenotypy (Schinzel, 1994). Lze předpokládat, že takové rozdíly jsou důsledky vystavení každého jednotlivce jeho prostředí nebo exprese různých modifikujících genů. Plodný otec byl popsán s mikrodelecí, která se rozšířila, když byla přenesena na jeho neplodného syna (Stuppia et al ., 1996). Ačkoli proměnná rozšíření na hranicích delece mohou existovat mezi našimi různými členy rodiny, tato molekulární rozšíření nelze rozlišit intervalovým mapováním. Analýzou PCR se stejné STSs nepodařilo amplifikovat u našich pěti jedinců a Jižní hybridizace pomocí sondy DAZ potvrdila úplnou deleci tohoto genového shluku. I když je možné, že pozorované delece nejsou ve skutečnosti identické a přilehlé oblasti mohou obsahovat důležité geny, které modulují stupeň fenotypové exprese, tyto výsledky stále naznačují velké překrytí odstraněné Y DNA (včetně ztráty klastru genů DAZ) u každého jednotlivce této jedinečné rodiny.

byli jsme fascinováni skutečností, že probandův strýc (II-8) má neplodnost a azoospermii, ale žádnou zjevnou mikrodeleci testováním STS. Vzhledem k tomu, že analýza southern blot používající jak sondy RBM, tak DAZ, jakož i analýzy ryb pomocí kosmidu DAZ byly zcela normální, jsme nuceni dospět k závěru, že má jinou etiologii, která je základem jeho neplodnosti. Je pravda, že může mít menší nebo bodovou mutaci/poruchu nebo proximální/distální přeskupení, které není detekovatelné současnými metodami. Nedal v anamnéze expozici gonadotoxinům nebo jiným definovatelným faktorům, které by pravděpodobně ovlivnily spermatogenezi.

až donedávna měla mikrodelece Y malý klinický význam, protože člověk s delecí se obecně nebude reprodukovat. S využitím ICSI a aspirace spermií varlat (TESA)v kombinaci s IVF je však nyní možné, aby oligo/azoospermičtí muži s mikrodelecí Y dosáhli těhotenství (Mulhall et al ., 1997; Silber a kol., 1998, a individuální III-6). To podpořilo obavy, že taková těhotenství mohou produkovat mužské potomky s podobnými mikrodelecemi a následnou neplodností (Reijo et al ., 1996; Girardi a kol., 1997; Kremer a kol., 1997). Mikrodelece Yq může být skutečně přenášena na mužské potomky prostřednictvím ICSI (Kent-First et al., 1996). Rodina, kterou uvádíme, naznačuje, že muži s mikrodelecemi Yq (jako je jednotlivec II-1), kteří dosáhnou těhotenství, budou přenášet stejnou mikrodeleci a riziko neplodnosti na své syny (jednotlivci III-1, III-4, III-6, III-8). Proto by pacientům měl být před ICSI nabídnut screening Mikrodelece Y a měli by být poučeni o jistotě přenosu mikrodelece Yq a možné neplodnosti na jejich syny. Vzhledem k tomu, že další výzkum je zaměřen na genetické etiologie mužské neplodnosti, identifikace genů zapojených do spermatogeneze by měla poskytnout vhled do patofyziologie mužské neplodnosti a racionálnější základ pro zahájení terapie.

Děkujeme rodinám za spolupráci na studii; Dr. David C. Page za poskytnutí sondy DAZ cDNA a jeho neocenitelnou pomoc s tímto rukopisem; Dr. kun Ma za poskytnutí sondy MK5 (RBM1) cDNA; Dr. Peter Vogt pro DNA YQ mikrodeleted jednotlivců používaných k ověření naší metodiky STS PCR; a C. C. Yu a Patricia Lanzano za jejich neocenitelnou technickou pomoc.

tato studie byla částečně financována Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards.