mechanismy chromozomálního přeskupení v lidském genomu

patologické DSB jsou libovolně definovány jako DSB, které neslouží fyziologickému účelu a mohou vést k buněčné dysfunkci.

náhodné zlomy DNA způsobené ionizujícím zářením nebo oxidačními volnými radikály

v mnoha chromozomálních přeskupeních se zdá, že DSB V jednom nebo obou genech jsou umístěny náhodně ve velkých oblastech mnoha kilobáz. Náhodné umístění a zjevný nedostatek náchylnosti k sekvenci naznačují sekvenčně nespecifické mechanismy DSB, jako jsou oxidační volné radikály, ionizující záření, nebo méně často, spontánní hydrolýza páteře DNA.

asi polovina přirozeného ionizujícího záření prostředí pochází z přírodních těžkých kovů země, jako je uran, thorium a dokonce i draslík. Druhá polovina ionizujícího záření pochází z kosmického záření, které není zcela blokováno atmosférou. Celkem prochází každou z nás každou hodinu asi 3 x 108 částic ionizujícího záření, které za sebou produkují hydroxylové volné radikály z vody. Tento trakt hydroxylových volných radikálů způsobuje poškození shluků na DNA, čímž rozbíjí oba řetězce DNA.

asi 0,1% kyslíku, který dýcháme, je přeměněno na volné radikály . To generuje 3 x1022 volných radikálů za hodinu v každém z nás a tyto škodlivé volné radikály jsou distribuovány přes 1014 buněk lidského těla. Volné radikály způsobují převážně jednovláknové poškození DNA, ale dvě blízké takové události mohou mít za následek DSB.

RAG akce na kryptických RSS stránkách na off-cílových místech způsobem specifickým pro sekvenci: v (D)J-type přestávky

RSS heptamer/nonamer konsensus sekvence není v žádném případě jedinečná pro lokusy IG a TCR a komplex RAG může řezat na místech, která se podstatně liší od konsensu 16 bp . Minimálním motivem pro okusování hadrů je pouze CAC. Komplex RAG tak může působit na místech s antigenními receptory podobných RSS, nazývaných cryptic RSS (cRSS). K tomu dochází v mnoha přestavbách pozorovaných u akutního lymfoblastického lymfomu lidských T-buněk . V těchto případech namísto komplexu RAG spárování 12-RSS s 23-RSS, 12-RSS páry s 23-cRSS nebo 23-RSS páry s 12-cRSS. Tyto zlomy nazýváme zlomy typu V(D)J, protože se vyskytují stejným mechanismem jako normální rekombinace V (D)J, bez ohledu na skutečnost,že jedno z míst je mimo obvyklé lokusy antigenního receptoru (to znamená, že je mimo cíl).

působení hadru na struktury DNA bublin a další oblasti heterologie způsobem specifickým pro strukturu

kromě svého sekvenčně specifického způsobu řezání může komplex hadru také škrábat strukturně specifickým způsobem v místech přechodu z dsDNA na ssDNA, jako je tomu na okrajích struktur bublinkové DNA nebo dokonce jednobázových nesouladů . Taková aktivita komplexu RAG mohla vzniknout, protože komplex RAG je zvyklý na vytváření struktur vlásenky, což zahrnuje podstatné zkreslení DNA. Proto je jakákoli oblast nesouladu nebo sklouznutí potenciálním cílem pro okusování komplexem hadrů v lymfoidních buňkách.

RAG-zprostředkovaná transpozice jako mechanismus pro chromozomální přeskupení

od roku 1998 do roku 2007 několik laboratoří navrhlo, aby komplex RAG mohl vložit tupé konce obsahující RSS z rekombinace V (D)J, nazývané konce signálu, do nových míst v genomu. Toto se nazývá rag transpozice a vyskytuje se na nízké úrovni pomocí zkrácené formy rag proteinů zvaných core RAGs (Recenzováno v). Snahy o nalezení událostí transpozice RAG in vivo však ukázaly, že se jedná o mnohem méně časté než náhodná integrace DNA . Konečně neexistují žádné příklady lidských lymfoidních malignit (nebo jakéhokoli jiného typu malignity), kde byl genom změněn transpozičním vložením signálních konců RAG (nebo jakékoli jiné zjevné varianty takové transpozice).

akce podpory v místech mimo cíl

jak je uvedeno ve výše uvedené diskusi o rekombinaci třídního spínače, podpora může převést C na U nebo methyl C nebo T v jakékoli oblasti ssDNA. Zdá se, že k tomu dochází nejen na přepínacích sekvencích a variabilních doménách lokusů Ig, ale také na některých patologických místech, jako jsou některé onkogeny, jako je c-myc . Pokud jsou tyto regiony zaměřeny pomocí, mohou udržovat bodové mutace nebo DSB . Akce podpory v oblasti přepínače IgH během CSR a nezávislá akce podpory v genu c-myc za účelem vytvoření DSB jsou považovány za základ dvou iniciačních DSB v myších i lidských translokacích c-myc . Dalo by se považovat přestávky tohoto typu za přestávky typu CSR (jak je uvedeno výše v diskusi o rekombinaci třídního spínače) nebo přestávky typu SHM, kde SHM označuje události iniciované pomocí typu podobné tomu, co se obvykle vyskytuje při somatické hypermutaci.

předpokládaný kombinovaný účinek podpory a hadrů na místech CpG: přestávky typu CpG

Nedávno jsme hlásili, že DSB v určitých lokusech v translokacích pro-B/pre-B-B – 2 z t(14;18), bcl-1 z t(11;14) a E2A z t(1;19)-mají silný sklon k výskytu v dinukleotidové sekvenci CpG.

translokace bcl-2 je nejčastější translokací u rakoviny, která se vyskytuje u >90% folikulárních lymfomů a třetiny difúzních velkobuněčných lymfomů. Padesát procent zlomů v genu bcl-2 se vyskytuje v hlavní oblasti zlomu (MBR), což je 175 BP hotspot v 3 ‚nejvíce exonu v oblasti kódující 3‘ UTR. Dva méně často používané hotspoty jsou umístěny 18 a 29 kb dále distálně od genu bcl-2, 105 BP Bcl-2 intermediate cluster region (icr) a 561 BP Bcl-2 minor cluster region (mcr). Cílem DSB může být kterékoli z míst CpG v kterékoli z těchto tří translokačních zón bcl-2 . Třináct procent translokačních přestávek bcl-2 je umístěno v icr a 5% v mcr.

použití CPG platí také pro hlavní translokační cluster bcl-1, což je umístění zapojené do translokace t(11;14). Translokace bcl-1 se vyskytuje téměř ve všech lymfomech plášťových buněk, přičemž 30% přestávek se vyskytuje u 150 bp BCL-1 major translokace cluster (MTC).

přestávky typu CpG se vyskytují také u třetí lymfoidní malignity, T (1;19) v malém procentu pre-B ALLs, translokace, která se vyskytuje mezi genem Pbx1 a genem E2A. Přestávky v genu E2A se vyskytují v zóně pouze 23 bp a tyto DSB jsou také významně seskupeny kolem míst CpG . Všechny tři translokace zahrnující Bcl-2, bcl-1 a E2A se vyskytují ve fázi pro-B / pre-B vývoje B-buněk.

Bcl-2 MBR je reaktivní s chemickou sondou pro jednovláknové zvanou bisulfit . Stejně jako Bcl-2 MBR je tento BCL-1 MTC relativně malý (150 bp) a má podobnou reaktivitu jako bisulfit . Tyto vysoce bisulfit reaktivní zóny jsou bohaté na běhy Cs. Na základě kruhového dichroismu, rentgenové krystalografie, NMR a chemického sondování mají takové běhy Cs tendenci přijímat strukturu DNA, která je meziproduktem mezi DNA ve formě B a DNA ve formě a, nazývanou B / a-intermediate . B / a-intermediární struktura má rychlejší kinetiku otevření, možná představuje část pozorovaného zvýšení reaktivity bisulfitu. Takové neobvyklé oblasti DNA mohou být náchylnější k událostem sklouznutí, možná vyvolané replikací nebo transkripcí DNA. To pak může vysvětlit jejich zranitelnost v minichromozomálních rekombinačních testech .

Cs CPG uvnitř nebo přímo sousedící s těmito B/A-meziproduktovými zónami jsou vystaveny zvýšenému riziku deaminace . Tato deaminace se nevztahuje na všechny Cs v regionu,ale pouze Cs, které jsou v rámci stránek CpG. Jediným charakteristickým rysem těchto Cs v CPG je to, že mohou být methylovány dna methyltransferázou. Když pravidelné Cs deaminují, stávají se U, což má za následek nesoulad U:G. Ale když methyl Cs deaminuje, stávají se T, což má za následek nesoulad T:G. Oprava neshod U:G je velmi účinná, ale oprava neshod T:G není účinná. Ve skutečnosti je oprava nesouladu T:G tak neefektivní, že představuje asi polovinu bodových mutací v genu p53 v celé řadě lidských rakovin. Tyto t:g nesoulad stránky jsou vždy na stránkách CpG.

co způsobuje přerušení na těchto místech nesouladu T:G? Je zajímavé, že tato deaminace v těchto lymfoidních translokačních hotspotech se zdá, že se vyskytuje ve fázi diferenciace před B. Toto je fáze vývoje B buněk, kdy se rekombinace D až J vyskytuje nejintenzivněji. Vzhledem k tomu, že translokace bcl-2 a bcl-1 se vyskytují v této fázi, zdá se pravděpodobné, že se jedná o fázi translokace. Ukázali jsme, že hadrový komplex může způsobit DSB v místech malých bublinových struktur, a dokonce i neshody jednotlivých párů bází. (Jak bylo uvedeno výše, toto působení komplexu RAG odráží jeho strukturu specifickou nukleázovou aktivitu, možná vlastnost, která odráží akce specifické pro strukturu komplexu RAG během kroku tvorby vlásenky rekombinace V(D)J.) Proto jsme navrhli, aby komplex RAG vytvořil DSB v místech nesouladu T:G .

pokud komplex RAG způsobuje DSBs v místech CpG, tak proč se takové přestávky typu CpG nevyskytují v pre – T buňkách, které také exprimují komplex enzymu RAG? Linie B buněk exprimuje cytidindeaminázu pro rekombinaci třídního spínače a somatickou hypermutaci. Jak bylo uvedeno výše, tento enzym se nazývá aktivací indukovaná deamináza (AID). Pomoc je exprimována v B buňkách, ale ne v jiných somatických buňkách. Pomoc je nejvíce exprimována v B buňkách, když jsou v zárodečných centrech. V pre-B buňkách však byla popsána nízká úroveň exprese AID . Navíc se předpokládá, že B buňky právě opouštějící kostní dřeň, nazývané přechodné B buňky, vyjadřují pomoc . Proto existuje období, kdy B buňky dokončují rekombinaci V(D)J a začínají vyjadřovat pomoc, když jsou v B buňkách přítomny jak pomoc, tak komplex hadrů. Ukázalo se, že podpora je schopna deaminovat methyl C na T. proto, navrhujeme, že podpora je pravděpodobně zodpovědná za mutaci meC na T v místech CpG v časných B buňkách. Výsledný nesoulad T: G je pak řezán hadrovým komplexem, což má za následek DSB. Tento model vysvětluje tři vrcholy translokace umístěné v BCL-2 MBR, všechny jsou soustředěny na místech CpG .

jiné příčiny patologických DSB neznámého mechanismu

některé translokace jsou silně spojeny s léčbou inhibitorem TOPOIZIOMERÁZY typu II. Po takové terapii se u některých pacientů vyvinou sekundární malignity s těmito charakteristickými translokacemi. Topoizomerázy obecně dělají jedno-nebo dvouvláknové přestávky, aby se navíjely nebo uvolňovaly DNA, a proto mají jako součást své funkce nukleázovou aktivitu. Po navíjení nebo odvíjení DNA obvykle znovu uzavřou zlom(y). Bylo navrženo, že přerušení nebo prevence opětovného uzavření může vést ke stabilním zlomům pozorovaným v chromozomálních přeskupeních .

některé DSB vznikají na místech v blízkosti přímých nebo obrácených opakování DNA. Takové opakování může vést ke vzniku sklouzaných struktur DNA obsahujících oblasti jednovláknové DNA, které mohou být terčem štěpení. Nejlepším příkladem je konstituční translokace t (11; 22) (q23; q11), která obsahuje palindrom bohatý na několik set bází s potenciálem pro tvorbu křížů.

kombinace více mechanismů DSB v rámci přeskupení

vzhledem k tomu, že pro generování translokace jsou vyžadovány dva DSB, tyto dva zlomy často spolu nesouvisejí. Například v translokacích bcl-2 a bcl-1 je zlom v lokusu IgH zlomem typu v(D)J generovaným sekvenčně specifickým působením komplexu RAG během rekombinace V (D)J. (Dalo by se to považovat za selhání při dokončení normálního procesu rekombinace V (D)J .) DSB na lokusu bcl-2 nebo bcl-1 je zlom typu CpG, který byl navržen tak, aby byl způsoben postupným působením podpory a strukturou specifickou nickingovou aktivitou komplexu RAG .

i v rámci daného lokusu může existovat široká škála mechanismů DSB. Lokusy SCL a LMO2 převážně udržují DSB typu v (D)J, ale jedna třetina nebo více DSB jsou nekompatibilní s požadavky sekvence pro DSB typu v (D)J a mohou být způsobeny poškozením volnými radikály, ionizujícím zářením nebo selháním topoizomerázy. Různé lokusy v jedné buňce jsou proto náchylné k různým typům mechanismů DSB.

replikací indukované DSB

během replikace DNA mohou vzniknout delece v důsledku sklouznutí syntetizujícího řetězce na templátovém řetězci. Chromozomální přeskupení, ke kterým dochází na specifických hotspotech, ať už u rakoviny v somatických buňkách nebo během gametogeneze/počátečních vývojových divizí jako konstituční translokace, se nazývají opakující se translokace, které lze vidět u mnoha pacientů. Nonrecurrent translokace jsou ty, které se vyskytují na různých místech od jednoho pacienta k druhému, ale mění nebo inaktivují gen, který způsobuje onemocnění. Na rozdíl od opakujících se translokací, o kterých jsme hovořili výše v cancer, zdá se, že mechanismy, které způsobují výměnu pramenů v neproudných translokacích, zahrnují přepínání šablon během replikační syntézy DNA. Tyto templátové přepínače se mohou vyskytovat v malých oblastech homologie sekvence DNA, jako je 5 bp. Toto přepínání šablon se nazývá mikrohomologií zprostředkovaná replikace indukovaná zlomením (MMBIR) nebo zastavení vidlice a přepínání šablon (FoSTeS). Pro nonrekurentní translokační křižovatky, které zahrnují několik dlouhých úseků sekvence z oblastí genomu, které jsou normálně od sebe odděleny, jako mechanismus bylo navrženo více událostí přepínání šablon .