mikroskopie ve výchozím nastavení je technika, která nám umožňuje pozorovat spíše než měřit biologické události a vyvodit závěry na základě toho, co vidíme, spíše než na základě některých výpočtů. Téma tohoto článku se proto může zdát trochu překvapivé, protože se zabývá měřením kolokalizace. I když existují situace, kdy můžete vizuálně určit kolokalizaci bílkovin, bude často nutné přesnější potvrzení vzájemné distribuce dvou sond.
proč je vizuální stanovení Kolokalizace nedostatečné?
pouze pokud jste shromáždili snímky podle kontrolovaného protokolu pro analýzu kolokalizace (dostatečný signál v každém kanálu, žádná autofluorescence nebo prokrvení signálu), lze s jistotou říci, že obě sondy kolokalizují pouze na základě pozorování. V tomto případě, pokud zelený signál kolokalizuje s červeným signálem a obraz je většinou žlutý, není potřeba žádné statistické měření. Ale pokud nevidíte překrývání, neznamená to, že tam není! Je možné, že intenzity obou kanálů nejsou stejné. Konkrétně mezilehlá barva, kterou vidíme, se může objevit pouze v případě, že obě sondy mají stejnou intenzitu. Závěry založené na vizuálním určení proto mohou často vést k falešně negativním výsledkům.
jaké metody pro měření překrytí existují?
i když neexistuje žádný standardní přístup k této záležitosti, existují dvě metody, které jsou široce používány a obecně přijímány. Jedná se buď o Pearsonův korelační koeficient (PCC) nebo Manderův kolokalizační koeficient (MCC).
tyto dvě metody se týkají dvou různých aspektů kolokalizace-korelace a společného výskytu. Pearsonův koeficient souvisí s korelací intenzit pixelů ve dvou kanálech. Měří vztah mezi signály-zda hodnoty signálu v jednom kanálu stoupají současně s druhým, nebo jeden signál klesá, když druhý stoupá. Korelace se liší od společného výskytu, který je matematicky vyjádřen Manderovým koeficientem. To představuje pokrytí jednoho signálu nad druhým, což odhaluje, do jaké míry dvě sondy zaujímají stejné místo. Pojďme to prozkoumat trochu dále.
Pearsonův korelační koeficient (PCC)
definice: PCC odráží lineární vztah mezi intenzitami signálu. Hodnoty se mohou pohybovat mezi 1 (dokonalá pozitivní korelace) a -1 (dokonalá negativní korelace), zatímco 0 znamená, že neexistuje žádná korelace. Je možné prozkoumat PCC vizuálně pomocí scattergramu, kde souřadnice na grafu představují hodnoty pixelů (signál) v obou kanálech. Čím více bodů se shlukuje kolem přímky, tím lepší je korelace mezi dvěma signály
požadavky: PCC by měl být měřen v oblasti zájmu (ROI), aby se zabránilo falešným pozitivům nebo negativům. Při měření PCC na celém obrázku budou pixely pozadí dokonale korelovat a nafouknout PCC. Naproti tomu, pokud se měření provádí v oblasti, která není zajímavá, kde existuje heterogenní distribuce obou kanálů, bude PCC stlačena.
ROI můžete vybrat ručně nebo prahováním, abyste vyloučili pozadí. Ať už to uděláte jakýmkoli způsobem, buďte opatrní, zejména při prahování. Výběr ROI musí zahrnovat všechny příslušné oblasti buňky(buněk), tj. každé místo, kde lze očekávat distribuci sondy. Pokud pro výběr ROI (prahování) používáte metodu založenou na intenzitě, můžete nechtěně vyloučit relevantní výsledky. Jak se to může stát? Mohli byste mít oblast vzájemného vyloučení, kde se neobjeví ani jeden štítek, a to může být biologicky relevantní výsledek (obě molekuly nejsou exprimovány na tomto místě v buňce). Prahová hodnota však tuto oblast nezahrnuje do návratnosti investic, což vás vystavuje nebezpečí ztráty relevantních výsledků.
doporučeno pro: PCC by měl být použit na obrázcích, Pokud existuje lineární vztah mezi intenzitami. Pokud se data hodí do složitějšího modelu, PCC nebude fungovat dobře. Jiná metoda by měla být také zvolena, pokud existuje nerovnoměrné překrytí, kde se sondy společně distribuují, ale v různých poměrech. K tomu může dojít, pokud se GFP používá jako jedna sonda. Jeho úroveň exprese se může mezi buňkami lišit a potenciálně způsobit depresi PCC kvůli vysoké variabilitě mezi buňkami.
Manderovy Kolokalizační koeficienty
definice: MCC je metrika, která popisuje společný výskyt-frakci jednoho proteinu, který se kolokalizuje s druhým. MCC vám dá dobrou míru kolokalizace, když označíte jeden protein ve vezikule a chcete vidět, jak se kolokalizuje s určitou strukturou v buňce, řekněme mikrotubule. Pokud předpokládáme, že všechny vezikuly kolokalizují s mikrotubuly, ale pouze část mikrotubulů kolokalizuje s vezikulem, můžete vypočítat MCC pro každý kanál a získat metriku, která kvantitativně popisuje toto frakční překrytí.
požadavky: úlovek s MCC spočívá v tom, že vyžaduje odstranění pozadí. Nejsložitější částí je nastavení mezního bodu pro intenzitu, který umožní odčítání pozadí. MCC měří úplnou fluorescenci jedné sondy v každém pixelu nad nulou. Nad nulovými pixely jsou však extrémně vzácné kvůli faktorům, jako jsou: autofluorescence, únik světla, nespecifické značení nebo fluorescence z rovin zaostřeného obrazu. Měření MCC proto vyžaduje pečlivý výběr prahové hodnoty (mezní hodnoty).
první způsob, jak toho dosáhnout, je globální prahová hodnota, kde odečtete prahovou hodnotu od každého pixelu, takže každá úroveň pod vybraným mezním bodem bude pozadí a každý pixel výše bude spadat do oblasti zájmu. I když je to velmi intuitivní, globální prahování je poměrně hrubé a může vést k nežádoucím situacím, jako je vyloučení pixelů s nízkou hodnotou, které jsou blízké pozadí, ale ve skutečnosti jsou pozitivní.
automatičtější a méně subjektivní možností je Costesova metoda, kde se prahová hodnota odhaduje vícekrát výpočtem PCC. To slouží k definování rozsahu hodnot pixelů, které jsou pozitivní, a proto by neměly být vyloučeny. PCC se vypočítá pro různé skupiny pixelů a hodnoty pixelů, pro které se PCC rovná nebo blíží nule, se berou jako prahové hodnoty. Mělo by se však také zkontrolovat vizuálně, protože u obrázků s nižším poměrem signál-šum může identifikovat velmi nízkou prahovou úroveň, takže nerozlišuje označené struktury od pozadí.
doporučeno pro: pokud se biologická otázka vašeho experimentu týká rozsahu překrývání proteinů/struktur, MCC by měla být měřítkem volby. Tyto koeficienty jsou intuitivněji interpretovány než PCC a jsou nezávislé na proporcionalitě signálu (rozdíly v počtu struktur označených každou sondou).
než začnete s analýzou
bez ohledu na to, jakou volbu pro měření kolokalizace zvolíte, je velmi důležité, aby kolekce obrázků byla provedena správným způsobem. Pokuste se ovládat co nejvíce faktorů a připravte sadu kontrolních vzorků, které vám umožní sledovat co nejvíce proměnných.
mějte na paměti, že stanovení vizuální kolokalizace je ovlivněno mnoha faktory, včetně subjektivity pozorovatele, skutečnosti, že mozky každého jednotlivce mohou vidět barvy odlišně, možné barevné slepoty pozorovatele a prostorového rozlišení, které určuje velikost pixelu, mimo jiné. Nezapomeňte zpracovat obrázky, které se chystáte analyzovat, jednotným způsobem a mějte na paměti, že jakákoli nekontrolovaná manipulace může způsobit ztrátu relevantních informací.
a v neposlední řadě
tyto výpočty jsou implementovány ve většině softwarových balíků pro analýzu obrazu, např. ImageJ a Volocity. Ale vzhledem k tomu, že měření kolokalizace je stále poněkud matoucí pole, jsou nutná vylepšení, takže Sledujte nové verze a balíčky pro software.
jak měříte kolokalizaci? Dejte nám vědět psaním do sekce komentářů!
literatura:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Praktický průvodce hodnocením kolokalizace v biologické mikroskopii. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Kolokalizační analýza ve fluorescenční mikroskopii. In: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (ed.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, pp.97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Statistické testy pro měření kolokalizace v biologické mikroskopii. Žurnál mikroskopie. 2013; 252(3): 295-302
pomohlo vám to? Pak prosím sdílejte s vaší sítí.