klonální hematopoézou u pacientů s vaskulitidou spojenou s anti-neutrofilními cytoplazmatickými protilátkami

klonální hematopoézou neurčitého potenciálu (CHIP)-definovanou přítomností somatické hematologické genové mutace spojené s rakovinou s variantní frekvencí alely ≥2%-se vyskytuje v periferní krvi nejméně 10% osob starších než 60 let bez anamnézy hematologické poruchy.21 mutace ovlivňují hlavně epigenetické regulátory transkripce DNMT3A, TET2 a ASXL1, což vede ke konkurenční výhodě mutovaných hematopoetických kmenových buněk s následným diferenciačním zkreslením směrem k myeloidnímu kompartmentu.43 frekvence CHIP se zvyšuje s věkem a spojuje se s vyšším rizikem vzniku hematologických malignit a kardiovaskulárních onemocnění, což vede ke zvýšené celkové mortalitě.5

pomocí myšího modelu s makrofágy s deficitem Tet2 bylo prokázáno, že ateroskleróza a ischemická choroba srdeční jsou řízeny CHIP prostřednictvím změněné funkce inflammasomu, což vede ke zvýšeným hladinám prozánětlivých cytokinů.6 naše skupina nedávno zjistila korelaci mezi mutacemi DNMT3A a chronickým onemocněním štěpu proti hostiteli, což poskytuje další důkaz o důležité roli CHIP v chronických zánětlivých reakcích.7 o úloze čipu v autoimunitních onemocněních je však známo jen málo. Studie u 56 pacientů s revmatoidní artritidou neprokázala žádnou korelaci CHIP s aktivitou onemocnění.8 autoimunitní vaskulitidy spojené s anti-neutrofilními cytoplazmatickými protilátkami (ANCA) zahrnují různé nekrotizující vaskulitidy, včetně granulomatózy s polyangiitidou a mikroskopickou polyangiitidou, a jsou charakterizovány závažným zánětem malých cév, který potenciálně ovlivňuje každý orgánový systém. ANCA jsou namířeny proti autoantigenům myeloperoxidázy (MPO) a proteinázy 3 (PR3). Po vazbě na jejich antigeny exprimované na povrchu buněk vyvolává Anca IgG nekontrolovanou aktivaci neutrofilů a monocytů, což vede k poškození endotelu a selhání koncových orgánů. U většiny jedinců lze nejvyšší mutační zátěž čipu nalézt v myeloidních buňkách, 4, které jsou jedinými buňkami primárního reagujícího na autoantigen exprimujícími v AAV. Kromě toho hrají TET2 a DNMT3A ústřední roli při umlčování genů regulací methylace DNA. Ve skutečnosti bylo hlášeno defektní umlčování genů v myeloidních buňkách od pacientů s AAV. Tento dysregulovaný proces zahrnoval autoantigeny ANCA a koreloval s rizikem relapsu.119

stručně řečeno, nedávné údaje podporují myšlenku potenciálních vazeb, pokud jde o patogenezi a klinické výsledky, mezi CHIP a autoimunitními chorobami / zánětlivými stavy. Proto jsme charakterizovali CHIP ve Velké kohortě pacientů s AAV, zkoumání prevalence, dynamické změny v čase, projevy orgánů,umlčení antigenu ANCA, a aktivace in vitro indukovaná ANCA.

odebrali jsme vzorky periferní krve od pacientů s AAV, které byly pozorovány na ambulancích a odděleních Charité/HELIOS nephrology (Berlín, Německo, od dubna 2005 do října 2018. Demografické a klinické údaje pacientů byly získány z jejich lékařských záznamů. Všichni pacienti dali písemný informovaný souhlas se zařazením do studie, která byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací. Etické schválení bylo získáno od místních etických komisí.

celá krevní DNA byla vyšetřena na čip pomocí přizpůsobené verze myeloidního sekvenačního panelu Illumina TruSight (online doplňková tabulka S1) na sekvenceru NextSeq. Sekvenční analýza byla provedena pomocí sekvenčního rozbočovače platformy Illumina BaseSpace. Byly zahrnuty pouze nesynonymní varianty s frekvencí alely ≥2%. Kandidátské varianty byly validovány cíleným hlubokým sekvenováním (online doplňkové metody). Celkem 46 somatických mutací bylo identifikováno u 34 ze 112 pacientů s AAV (30,4%) se střední frekvencí variantní alely 5.2% (Online Doplňková Tabulka S2). Zatímco 25 pacientů mělo jednu mutaci, osm mělo dvě a jeden pacient měl pět. Nejčastěji mutovanými geny byly DNMT3A (19/46=39,1%), TET2 (7/46=15,2%) a ASXL1 (4/46=8,7%) (obrázek 1A). Mezi 46 mutacemi bylo 26 missense, 18 bylo zkráceno a dvě byly mutace v místě spojení. Nejčastější změnou báze u mutací missense byla C > T (16/30) (online doplňující obrázek S1).

Obrázek 1.Sekvenční analýza. (A) spektrum somatických genových mutací nalezených v naší kohortě 112 pacientů s autoimunitní vaskulitidou asociovanou s ANCA (AAV). Geny označené hvězdičkou jsou pokryty pouze vlastním panelem (online doplňkové metody). (B) Prevalence klonální hematopoézy neurčitého potenciálu (CHIP) podle věkových skupin. Pacienti s jedinou mutací jsou zastoupeni ve světle modré barvě, pacienti s více mutacemi v tmavě modré barvě. (C) srovnání prevalence čipů v kohortě AAV s prevalencí v dříve popsaných kohortách. Chybové pruhy zobrazují 95% intervaly spolehlivosti. (D) podélná kvantifikace variantních frekvencí alely (VAF) u vybraných pacientů. Jsou zobrazeni pouze pacienti s relevantním zvýšením nebo snížením VAF v průběhu času. Podávané léčebné režimy jsou zobrazeny jako barevné pruhy na ose x. Relaps je reprezentován trojúhelníky. UPN: jedinečné číslo pacienta; AZA: azathioprin; CYC: cyklofosfamid; MTX: methotrexát; MMF: mykofenolát mofetil; RTX: rituximab.

ve srovnání s dříve hlášenou prevalencí CHIP v nevybraných kontrolních kohortách podobného věku a sekvenační technologie,15128743 prevalence CHIP u pacientů s AAV byla významně vyšší (30,4% vs. 13,5%, P<0,001) (obrázek 1C, online doplňková tabulka S3). S ohledem na různé technologie sekvenování použité v těchto studiích jsme zkoumali kontrolní kohortu odpovídající věku a pohlaví 112 zdravých jedinců, mezi nimiž bylo nalezeno 22 mutací u 20 subjektů (zdravé kontroly vs. pacienti s AAV: 17,9% vs. 30,4%, P=0.042) (Online Doplňková Tabulka S4, Online Doplňkové Údaje S2-S4). Za zmínku stojí, že jsme zjistili relevantní podíl pacientů s AAV s CHIP ve věku ≤55 let (6/33=18,2%) (obrázek 1B). Následné vzorky periferní krve byly k dispozici u 19 pacientů s CHIP AAV. Medián sledování byl 2,3 roku (rozmezí 0,3-10,9 roku). Mutační zátěž sériových vzorků od těchto 19 pacientů ve dvou až čtyřech časových bodech byla kvantifikována hlubokým sekvenováním.171674 zatímco u pěti pacientů došlo k významnému zvýšení velikosti klonů, u dvou pacientů došlo k mírnému poklesu klonů a u 12 pacientů nedošlo v průběhu času ke změně velikosti klonů (obrázek 1D, online Doplňkový obrázek S5). Dále jsme zkoumali jeden následný vzorek od každého z 20 pacientů s čipem, shromážděných 2 až 10 let po počátečním vzorku. Žádný z 20 následných vzorků nevykazoval novou mutaci.

byly provedeny průzkumné statistické analýzy k identifikaci souvislostí mezi čipem a klinickými parametry (76 pacientů s granulomatózou s polyangiitidou a 34 s mikroskopickou polyangiitidou). Pacienti s CHIP byli významně starší než pacienti s CHIP (medián 70, 5 vs. 63, 0 let, p=0, 017). Prevalence CHIP nebyla vyšší u pacientů, kteří dostávali imunosupresivní léčbu před odběrem vzorků (100% steroidy, 90% cyklofosfamid, 20% rituximab, 16% azathioprin, 13% methotrexát). Nebyly pozorovány žádné rozdíly v krevním obrazu, šířce distribuce červených krvinek, hladinách kreatininu, komorbiditách, rozvoji malignit, stavu aktivity onemocnění a riziku relapsu AAV s ohledem na stav CHIP. Vzorce manifestace onemocnění se však lišily: pacienti s CHIP postiženými granulomatózou s polyangiitidou vykazovali méně onemocnění ledvin (68,2% vs. 88,5%, P=0,049) a postižení nervového systému (0% vs. 19,2%, P=0,028) (online doplňkové tabulky S5-S8, online doplňkové údaje S6-S8).

dále jsme se zaměřili na zkoumání umlčení antigenu ANCA a aktivace in vitro indukované ANCA. Za tímto účelem byly in vitro provedeny stimulační testy neutrofilů pomocí oxidace dihydrorhodaminu monoklonálními protilátkami proti antigenům Anca MPO a PR3 u podskupiny pacientů s AAV a zdravých kontrol (online doplňkové metody), kteří měli negativní test na CHIP. U CHIP byla pozorována snížená aktivace ve srovnání s pacienty s CHIP AAV (anti-MPO: stimulační index: 6,29 vs. 13,01, P=0,057; anti-PR3: stimulační index 7,72 vs. 13,00, P=0. 026) (obrázek 2A), zatímco nebyl pozorován žádný rozdíl v indexu membránové exprese nebo procentu pozitivních buněk (obrázek 2B, C). Kromě toho byly kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí měřeny hladiny mRNA v periferní krvi PR3, MPO, CD177, RUNX3 a JMJD3. Pacienti s CHIP AAV vykazovali zvýšenou expresi mRNA MPO a PR3 ve srovnání s hladinami u zdravých kontrol (MPO: 1, 94 vs. 0, 86, P=0, 026; PR3: 2, 02 vs. 0, 58, P=0, 057), což byl rozdíl, který byl u pacientů s CHIP méně patrný. Pacienti s CHIP AAV však vykazovali sníženou expresi mRNA RUNX3 ve srovnání s hladinou u zdravých kontrol (0 .28 vs. 0,79, P=0,007) (Obrázek 2). Vzhledem k malému počtu pacientů jsme nebyli schopni dále rozdělit pacienty s CHIP AAV podle postižených genů nebo variantní alely frekvence, a proto jsme nemohli vyhodnotit jejich potenciální dopad na naše nálezy (online doplňková tabulka S9). Navíc významné rozdíly v počtu neutrofilů a lymfocytů mezi pacienty s AAV a zdravými kontrolami mohly ovlivnit naše výsledky a omezit schopnost vyvodit obecné závěry (online doplňková tabulka S10).

Obrázek 2.Funkční data. Jednotlivé datové body jsou zobrazeny v scatterplots a shrnuty v boxplots. (A) detekce oxidačního roztržení neutrofilů pomocí DHR testu; znázorněn je stimulační index SI = Střední fluorescence kanálů stimulovaných versus nestimulovaných buněk, (B, C) exprese neutrofilní membrány CD177 nebo PR3 měřená na izolovaných neutrofilech průtokovou cytometrií pomocí anti-NB1 nebo anti-PR3 protilátek, znázorněná jako index exprese EI (B) nebo procento mpr3 – a CD177-pozitivních buněk (C). EI = (MFIstimulated cells – MFIunstimulated cells) /MFIunstimulated cells. (D) mRNA expression measured in PB leukocytes with qPCR. (m)PR3: (membrane-)proteinase 3; MPO: myeloperoxidase; RUNX3: Runt-related transcription factor 3; JMJD3: jumonji domain-containing protein 3; DHR: dihydrorhodamine; NB1: neutrophil-specific antigen; PB: peripheral blood; EI: expression index; SI: stimulation index; MFI: mean fluorescence intensity.

In summary, we detected CHIP in 34 out of 112 patients (30.4%), významně vyšší prevalence, než byla hlášena u zdravých kohort a v naší kontrolní skupině odpovídající věku, ale srovnatelná se zvýšenou frekvencí hlášenou u pacientů s rakovinou, 12 aplastickou anémií18 a kardiovaskulární onemocnění.5 zatímco změněná zánětlivá signalizace byla navržena jako mechanismus, který je základem asociace myelodysplastických syndromů s autoimunitními chorobami / zánětlivými stavy,19 podobný mechanismus by mohl spojit CHIP s takovými stavy a zejména s AAV. Dysregulovaná transkripce AUTOANTIGENU ANCA je běžně pozorována v AAV a může být změněna čipem. Zajímavé je, že pacienti s čipem, ale ne čipem AAV se objeviliregulace exprese mRNA autoantigenu, která byla dříve hlášena.119 toto poměrně překvapivé zjištění naznačuje, že upregulovaná exprese antigenu ANCA je pravděpodobně sekundárním jevem v AAV, indukovaným zánětlivou signalizací, která je defektní v čipových buňkách. V souladu s tím byla u pacientů s čipem pozorována snížená aktivace neutrofilů indukovaná ANCA. Je zajímavé, že jsme již dříve prokázali, že produkce reaktivních druhů kyslíku indukovaná ANCA hraje hlavní roli při downregulaci aktivace inflammasomu oxidační inhibicí kaskády inflammasome-kaspáza-1-interleukin-1β.20 snížená produkce reaktivních druhů kyslíku čipovými neutrofily, které jsme našli, by proto mohla přispět k nadměrné aktivaci inflammasomu a tím ovlivnit patogenezi AAV. Klinicky jsme zjistili méně renálních a neuronálních projevů u pacientů s čipem, což podporuje myšlenku, že čip funguje jako modifikátor onemocnění v AAV.

v longitudinální analýze více než 25% pacientů vykázalo zvýšení velikosti klonu v průběhu času bez významného vlivu specifické léčby na expanzi klonů. Frekvence CHIP nebyla zvýšena u pacientů dříve léčených imunosupresivními / cytotoxickými látkami a nebyla obohacena o mutace podílející se na odpovědi na poškození DNA (Online doplňková tabulka S11). Proto se zdá nepravděpodobné, že vysoká prevalence CHIP je pouze důsledkem cytotoxické léčby a spolu s rozšiřujícími se velikostmi klonů vyžaduje bližší sledování postižených pacientů s AAV kvůli známému riziku progrese myelodysplastických syndromů nebo akutní myeloidní leukémie.1513

společně naše data odhalují novou asociaci AAV s čipem s potenciálně modifikujícími účinky, jak je ukázáno pro aktivaci neutrofilů, regulaci transkripce autoantigenu a projev orgánů. Uznáváme, že vzhledem k více testům hodnoty P nepředstavují globální chybu typu I. Budoucí studie a funkční vyšetřování jsou nyní oprávněné k potvrzení těchto výsledků a dešifrování molekulárních mechanismů.

1. Genovese G, Kahler AK, Handsaker RE. Klonální hematopoéza a riziko rakoviny krve odvozené ze sekvence krevní DNA. N Engl J Med. 2014; 371(26):2477-2487. PubMedhttps://Doi.org/10.1056 / NEJMoa1409405Google Scholar
2. Steensma DP, Bejar R, Jaiswal s. Klonální hematopoéza neurčitého potenciálu a její rozlišení od myelodysplastických syndromů. Krev. 2015; 126(1):9-16. PubMedhttps://doi.org / 10.1182 / krev-2015-03-631747Google Scholar
3. Buscarlet M, Provost S, Zada YF. DNMT3A a TET2 dominují klonální hematopoéze a vykazují benigní fenotypy a různé genetické predispozice. Krev. 2017; 130(6):753-762. PubMedhttps://doi.org / 10.1182 / krev-2017-04-777029Google Scholar
4. Arends CM, Galan-Sousa J, Hoyer k. distribuce hematopoetické linie a evoluční dynamika klonální hematopoézy. Leukémie. 2018; 32(9):1908-1919. PubMedhttps://doi.org/10.1038/s41375-018-0047-7Google Scholar
5. Jaiswal S, Natarajan P, Silver AJ. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. N Engl J Med. 2017; 377(2):111-121. PubMedhttps://doi.org/10.1056/NEJMoa1701719Google Scholar
6. Fuster JJ, MacLauchlan S, Zuriaga MA. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 2017; 355(6327):842-847. PubMedhttps://doi.org/10.1126/science.aag1381Google Scholar
7. Frick M, Chan W, Arends CM. Role dárcovské klonální hematopoézy při alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk. J Clin Oncol. 2019; 37(5):375-385. PubMedGoogle Scholar
8. Savola P, Lundgren S, Keranen MAI. Klonální hematopoéza u pacientů s revmatoidní artritidou. Rakovina Krve J. 2018; 8 (8): 69. Google Scholar
9. Ciavatta DJ, Yang J, Preston GA. Epigenetický základ pro aberantní upregulaci autoantigenových genů u lidí s ANCA vaskulitidou. J Clin Invest. 2010; 120(9):3209-3219. PubMedhttps://doi.org/10.1172 / JCI40034Google Scholar
10. Jones BE, Yang J, Muthigi a. Gene-specific DNA methylation changes predict remission in patients with ANCA-associated vasculitis. J Am Soc Nephrol. 2017; 28(4):1175-1187. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2016050548Google Scholar
11. McInnis EA, Badhwar AK, Muthigi A. Dysregulation of autoantigen genes in ANCA-associated vasculitis involves alternative transcripts and new protein synthesis. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):390-399. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013101092Google Scholar
12. Coombs CC, Zehir A, Devlin SM. Klonální krvetvorba související s léčbou u pacientů s nehematologickým karcinomem je častá a spojená s nepříznivými klinickými výsledky. Buněčná Kmenová Buňka. 2017; 21(3):374-382.e4. PubMedhttps://Doi.org/10.1016 / j. stem.2017.07. 010 Google Scholar
13. Desai P, Mencia-Trinchant N, Savenkov o. somatické mutace předcházejí akutní myeloidní leukémii roky před diagnózou. Nat Med. 2018; 24(7):1015-1023. PubMedhttps://doi.org / 10.1038 / s41591-018-0081-Zgoogle Scholar
14. Gibson CJ, Lindsley RC, Tchekmedyian v. Klonální krvetvorba spojená s nepříznivými výsledky po autologní transplantaci kmenových buněk pro lymfom. J Clin Oncol. 2017; 35(14):1598-1605. PubMedGoogle Scholar
15. Abelson S, Collord G, Ng SWK. Predikce rizika akutní myeloidní leukémie u zdravých jedinců. Povaha. 2018; 559(7714):400-404. Google Scholar
16. Christen F, Hoyer K, Yoshida k. genomická krajina a klonální vývoj akutní myeloidní leukémie s t (8; 21): mezinárodní studie na 331 pacientech. Krev. 2019; 133(10):1140-1151. PubMedhttps://doi.org / 10.1182 / krev-2018-05-852822Google Scholar
17. Damm F, Mylonas E, Coson a. získal iniciační mutace v časných hematopoetických buňkách pacientů s CLL. Rakovina Objev. 2014; 4(9):1088-1101. PubMedhttps:/ / Doi.org / 10.1158 / 2159-8290. CD-14-0104Google Scholar
18. Yoshizato T, Dumitriu B, Hosokawa k. somatické mutace a klonální hematopoéza u aplastické anémie. N Engl J Med. 2015; 373(1):35-47. PubMedhttps:/ / Doi. org / 10.1056 / NEJMoa1414799Google Scholar
19. Sallman DA, seznam a. ústřední role zánětlivé signalizace v patogenezi myelodysplastických syndromů. Krev. 2019; 133(10):1039-1048. PubMedhttps://doi.org/10.1182/blood-2018-10-844654Google Scholar
20. Schreiber A, Luft FC, Kettritz R. Phagocyte NADPH oxidase restrains the inflammasome in ANCA-induced GN. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):411-424. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013111177Google Scholar