když přemýšlíte o separaci proteinů, přemýšlíte o jejich oddělení pomocí gelu? Konkrétně pomocí SDS-PAGE? Pokud jste odpověděli „ano“, je to z dobrého důvodu. SDS-PAGE je všudypřítomná v laboratořích molekulární biologie, protože je dobrá při separaci proteinů. SDS-PAGE však trvá hodně času a je náročná na práci. Pojďme tedy rozšířit svou sadu nástrojů a podívat se na jiný způsob separace proteinů: kapilární gelová elektroforéza.
kapilární gelová elektroforéza (CGE), také známa jako kapilární prosévací elektroforéza, také známa jako kapilární prosévací elektroforéza.a. SDS-kapilární gelová elektroforéza odděluje proteiny v gelu pomocí sloupců naplněných oddělovacím médiem.
požadavky na vybavení
v kapilární gelové elektroforéze vaše analyty (proteiny, které chcete studovat) migrují elektrolytickým roztokem přes kapiláry tažnou silou elektrického pole-ne na rozdíl od známější stránky SDS. K provedení CGE potřebujete: injekční lahvičku se vzorkem, zdrojové a cílové lahvičky, prosévací matrici, kapilární kolonu, detektor na sloupci, zařízení pro výstup a manipulaci s daty a vysokonapěťové napájení.
protokol stručně
v experimentu CGE váš vzorek začíná u zdrojové lahvičky a směřuje k cílové lahvičce. Zde je protokol ve stručnosti:
Krok 1: zdrojové a cílové lahvičky i kapiláry, které je spojují, se naplní elektrolytickým roztokem a vzorek se zavede do kapiláry.
Krok 2: Jakmile je aplikováno elektrické pole, analyty migrují ze strany zdrojové lahvičky na stranu cílové lahvičky.
Krok 3: detektor na sloupci (není divu) umožňuje detekci na sloupci. Detektor odesílá data do výstupního a manipulačního zařízení, jako je počítač.
Krok 4: Tato data se pak zobrazí jako elektroferogram. Vaše analyty se čtou jako vrcholy různých retenčních časů.
pro více informací o tom, jak to funguje, navštivte užitečný materiál UC Davis.
více o matrici
vaše prosévací matrice může být složena z řady polymerizovaných materiálů, včetně zesítěného polyakrylamidu, dextranu a poly (ethylenglykol nebo ethylenoxid). Vaše sloupce jsou obvykle vyrobeny z vyměnitelných prosévacích polymerů. Je pak jen na vás, zda si vytvoříte vlastní sloupce nebo si je koupíte. Beckman Coulter, laboratoře Agilent Tech a Bio-Rad prodávají prosévací soupravy, ale vědí, že vyžadují, abyste také používali jejich nástroje CGE.
proč byste měli používat CGE
Nyní jste slyšeli o tom, co je CGE, proč byste jej měli používat?
- má kratší provozní dobu. Spuštění CGE trvá 10-100 krát méně času než desková gelová elektroforéza.
- v experimentu CGE je méně kroků než v experimentu na stránce SDS. Je to proto, že konečné výsledky experimentu CGE jsou dány počítačem připojeným k přístroji.
- CGE je také vhodnější pro malé proteiny než tradiční SDS-PAGE.
- pomocí CGE můžete analyzovat své proteiny v reálném čase.
- CGE zařízení lze použít opakovaně, není třeba vyrábět nekonečné gely.
- a konečně, velká část procesu je automatická. Poté, co jste přidali vzorek, máte hotovo! To znamená, že nemusíte dohlížet na proces, jako byste dělali gel, nebo ho přivést do speciálního detekčního zařízení, jakmile gel běží.
proč byste neměli používat CGE
no, pravda, i když CGE existuje ve své současné podobě již více než deset let a bylo dosaženo mnoha technických pokroků, CGE stále trpí problémy s reprodukovatelností. Dalším problémem je, že separace CGE jsou prováděny v sérii. To znamená, že s CGE nemůžete pohodlně porovnávat pruhy. A konečně, pokud jde o 2D gely, CGE prostě nemůže konkurovat tradiční 2D separaci.
Stručně řečeno, zatímco někteří vědci hrdě volají po použití technologie CGE, stále s ní existuje řada problémů. Ale ještě nezavrhujte CGE! Nejnovějším tlakem v této oblasti je microchip CGE, který ukazuje mnoho slibů pro vysokorychlostní analýzu bílkovin. Takže až příště přemýšlíte o separaci bílkovin, nezapomeňte na CGE.
vyzkoušeli jste CGE? Jak se vám to líbí ve srovnání s SDS-PAGE?