jediná mutace ve vysoce konzervované oblasti chloramfenikol-acetyltransferázy umožňuje produkci isobutylacetátu přímo z celulózy Clostridium thermocellum za zvýšených teplot

bakteriální kmeny a plazmidy

bakteriální kmeny a plazmidy použité v této studii jsou uvedeny v tabulce 2. Kmen Clostridium thermocellum DSM1313 h hpt (M1354) byl použit jako hostitel pro výrobu esterů při zvýšených teplotách. Je třeba poznamenat, že delece genu hypoxanthin fosforibosyltransferázy (hpt, Clo1313_2927) v divokém typu DSM1313 umožňuje genetické inženýrství pomocí čítače 8-azahypoxanthinu (8-AZH); tato delece nemá žádný známý nepříznivý účinek na růst a metabolismus buněk . Plazmid pNW33N, obsahující CATSa, je termostabilní a byl používán k expresi různých koček v C. thermocellum. PET plazmidy byly použity pro molekulární klonování a expresi enzymů v E. coli.

chemikálie a činidla

všechny chemikálie byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (MO, USA) a/nebo Thermo Fisher Scientific (MA, USA), pokud není uvedeno jinde. Pro molekulární klonování byly restrikční enzymy a T4 ligáza získány z New England Biolabs (MA, USA). Pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) byla použita DNA polymeráza Phusion Hot Start II.

média a kultivace

pro molekulární klonování a expresi proteinů byly kmeny E. coli pěstovány v lysogenním bujónu (LB) obsahujícím vhodná antibiotika, pokud není uvedeno jinak. Pro in vivo charakterizaci CATSa v E. coli bylo použito hybridní médium M9 s 20 g / L glukózy. Pro kulturu C. thermocellum bylo použito médium MTC minimal nebo médium CTFuD-NY, jak bylo specifikováno v experimentech. Optická hustota (Od) byla měřena spektrofotometrem při vlnové délce 600 nm (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Multiple sequence alignment analysis

Multiple sequence alignment analysis (MSA) byla provedena pomocí MEGA7 . Proteinové sekvence byly zarovnány pomocí ClustalW a vizualizovány pomocí Esprit 3.0 (http://espript.ibcp.fr) . Klíčové vlastnosti proteinových struktur 3U9F, 4CLA a 2XAT byly extrahovány z CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX a CAT4_PSEAE.

molekulární modelování a dokovací simulace

trojrozměrné (3D) struktury

3D struktura CATSa a alkoholů, které jsou předmětem zájmu, byla nejprve generována pomocí Swiss-Model a nástrojů „Builder“ MŽP (Molecular Operating Environment software, verze 2019.01). 3D struktura komplexu catsa s dvojím substrátem (tj. acetyl-CoA–isobutanol–CATSa) byla získána extrakcí isobutanolu z komplexu isobutanol-CATSa a následným přidáním do komplexu acetyl-CoA–CATSa. Všechny konstrukce byly připraveny nástrojem „QuickPrep“ MŽP s výchozími parametry a dále optimalizovány minimalizací energie pomocí silového pole Amber10: EHT.

dokovací simulace

pro provedení dokovací simulace byla potenciální vazebná kapsa prohledána pomocí nástroje „Site Finder“ MŽP. Nejlépe hodnocené místo, v souladu s hlášenými katalytickými místy, byl vybrán pro další studie. Dokovací simulace byly provedeny, jak bylo popsáno výše . Stručně řečeno, acetyl-CoA a každý alkohol byly ukotveny pomocí indukovaného fit protokolu metodou umístění Triangle Matcher a londýnskou bodovací funkcí ΔG. Po dokovacích simulacích byla vybrána Nejlépe hodnocená vazebná pozice, ukazující rozhodující interakci mezi zbytkem a substrátem při odchylce od kořene-střední-čtverec (RMSD) < 2 Å. Jako příklad pro dokování acetyl-CoA byla zvolena vazebná póza vykazující vodíkovou vazbu mezi hydroxylem Ser-148 a N71 CoA . Pro dokování alkoholu byla zvolena vazebná pozice ukazující vodíkovou vazbu mezi N3 His-189 a hydroxylem alkoholu .

v analýze silico mutageneze

v analýze silico mutageneze komplexu acetyl-CoA-isobutanol-CATSa byla provedena, jak bylo popsáno výše . Konkrétně, nástroje „alanin scan“ a „residue scan“ MOE byly použity k identifikaci potenciálních kandidátů na rezidua pro mutagenezi.

molekulární klonování

Plazmidová konstrukce

plazmidy byly konstruovány standardní technikou molekulárního klonování metodou závislou na ligáze a / nebo Gibsonovou sestavou za použití primerů uvedených v doplňkovém souboru 1: tabulka S1. Konstruované plazmidy byly zavedeny do E.coli TOP10 transformací tepelným šokem. Kolonie izolované na selektivní destičce byly screenovány PCR a čištěny plazmidem. Purifikované plazmidy byly ověřeny sangerovým sekvenováním před transformací na E. coli BL21 (DE3). Site-directed mutagenesis byla provedena pomocí protokolu QuickChange™ site-directed mutagenesis se sníženou délkou překrytí nebo Gibsonovou metodou montáže . Pro C. thermocellum engineering byl nejprve zkonstruován plazmid pHS005 a poté upraven na pHS0024. pHS0024 nemá hpt na proudu operonu, zatímco jiné sekvence plazmidu jsou identické s pHS005.

transformace

konvenční metody chemické transformace a elektroporace byly použity pro transformaci E.coli a C. thermocellum. Pro C. thermocellum, metoda, nicméně, byl mírně upraven, jak je popsáno zde. Nejprve Byl C. thermocellum M1354 (Tabulka 2) kultivován v 50 mL CTFuD-NY média při 50 °C uvnitř anaerobní Komory (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., NEBO, USA). Buněčná kultura s OD v rozmezí 0,8-1,0 byla ochlazena při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Za tímto bodem byly všechny kroky provedeny mimo komoru. Chlazené buňky byly sklizeny při 6500×g a 4 °C po dobu 20 minut. Buněčné pelety byly dvakrát promyty ledem chlazenou Milli-Q vodou a resuspendovány ve 200 µL transformačního pufru sestávajícího z 250 mM sacharózy a 10% (obj./obj.) glycerolu. Několik 30 µL alikvotů elektrokompetentních buněk bylo okamžitě uloženo při-80 °C pro další použití. Pro elektroporaci byly elektrokompetentní buňky rozmrazeny na ledu a inkubovány s 500-1000 ng methylovaných plazmidů po dobu 10 minut. Poté byly buňky přeneseny do ledem chlazené elektroporační kyvety s mezerou 1 mm (BTX Harvard aparát, MA, USA) následované dvěma po sobě jdoucími exponenciálními impulsy rozpadu s 1.8 kV, 350 Ω a 25 µF. Impulsy obvykle vedly k časové konstantě 7,0–8,0 ms. Buňky byly okamžitě resuspendovány v předem zahřátém čerstvém CTFuD-NY a obnoveny při 50 °C za anaerobních podmínek (90% N2, 5% H2 a 5% CO2) uvnitř Balchové trubice s gumovým uzávěrem. Po 0-12 hodinách zotavení byly buňky smíchány s roztaveným agarovým médiem CTFuD-NY doplněným o 15 µg/mL thiamfenikolu. Nakonec se směs středních buněk nalije na Petriho misku a ztuhne uvnitř anaerobní Komory. Deska byla inkubována při 50 °C až 1 týden, dokud se neobjevily kolonie. Účinnost transformace byla 2-100 jednotek tvořících kolonie na µg plazmidu (CFU / µg plazmidu).

in vivo charakterizace CATSa a jejích variant v E. coli

pro in vivo charakterizaci CATSa a jejích variant v E.coli byly provedeny kultury s vysokou hustotou buněk, jak bylo dříve popsáno s přídavkem 2 g/L různých alkoholů. Pro extrakci esterů in situ byla každá zkumavka překryta 25% (obj./obj.) hexadekanem. Pro potvrzení proteinové exprese CATSa a jejích variant bylo 1% (v/v) zásobních buněk pěstováno přes noc při 37 °C a 200 ot / min v 15 mL kultivačních zkumavkách obsahujících 5 mL LB média a antibiotika. Poté byly 4% (obj./obj.) nočních kultur přeneseny do 1 mL LB média obsahujícího antibiotikum v 24jamkové mikrodestičce. Kultury byly pěstovány při 37 °C a 350 ot / min za použití inkubační mikrodestičkové třepačky (Fisher Scientific, PA, USA), dokud OD nedosáhla 0,4-0,6 a poté indukována 0.1 mM isopropyl β-d-1-thiogalaktopyranosid (IPTG) po dobu 4 hodin s těsnící membránou pro snadné dýchání, která zabraňuje odpařování a křížové kontaminaci (cat # 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). Vzorky proteinu byly získány za použití B-PER kompletního činidla (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA) podle pokynů výrobce a analyzovány pomocí SDS-PAGE.

charakterizace enzymů

purifikace his-tagu

pro expresi enzymů byla přes noc kultura naočkována 1:Poměr 50 v čerstvém LB médiu obsahujícím 1 mM IPTG a antibiotikum, následovaná noční inkubací 18 °C (až 20 h) v třepacím inkubátoru při 200 ot / min. Indukované buňky byly sklizeny centrifugací při 4 °C a 4700×g po dobu 10 minut. Buněčná peleta byla poté jednou promyta Miliporovou vodou a resuspendována v B-PER úplném činidle. Po 30 min inkubaci při pokojové teplotě byla směs odstředěna při 17 000×g po dobu 2 minut. Supernatant byl odebrán a označen jako surový extrakt. Pro jeho-tag čištění, surový extrakt byl inkubován s hispur Ni–NTA superflow agarosou v dávce, jak doporučuje výrobce. Potom se pryskyřice promyje nejméně třemi objemy promývacího pufru, sestávajícího z 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu a 0,1 mM EDTA. Proteiny vázané na pryskyřici byly eluovány elučním pufrem 300 µL obsahujícím 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 300 mM imidazol a 0,1 mM EDTA. Eluovaný vzorek byl poté odsolen a koncentrován pomocí kolony filtru Amicon s mezní molekulovou hmotností 10 kDa. Nakonec byl vzorek proteinu suspendován ve 200 µL 20 mM Tris-HCl pufru (pH 8,0). Koncentrace proteinu byla měřena Bradfordovým testem s bovinním sérovým albuminem (BSA) jako referenčním proteinem.

Thermal shift assay

pro měření teploty tání proteinu (Tm) byl použit termofluorový test se Sypro Orange . Asi 10-250 µg purifikovaného proteinu His-tag bylo smícháno s 5× SYPRO Orange v konečném objemu 50 µL v 96jamkové qPCR destičce. Deska byla před provedením testu utěsněna uzávěry PCR. PCR stroj StepOne v reálném čase (Applied Biosystems, CA, USA) byl použit ke spuštění testu s následujícími parametry: reportér ROX, přírůstek 1 °C na cyklus, držení 1 minuty v každém cyklu a teplotní rozsah od 20 do 98 °C. data byla shromážděna, exportována a zpracována pro výpočet Tm.

5,5 ‚ -dithiobis-(kyselina 2-nitrobenzoová) (DTNB) test

reakční rychlost pro každou kočku byla stanovena DTNB testem v 384 jamkové destičce. Celkový reakční objem byl 50 µL s reakčním pufrem obsahujícím 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Koncentrace acetyl – CoA (CoALA Biosciences, TX, USA) a alkoholů byly různé, jak je uvedeno v každém experimentu. Pro reakce na chloramfenikol byly použity konečné koncentrace enzymu 0,05 µg/mL a 10 µg/ml. Reakční kinetika byla shromážděna měřením absorbance při 412 nm každou minutu po dobu 1 h při 50 °C ve čtečce mikrodestiček (Synergy HTX microplate reader, BioTek). Reakční rychlost byla vypočtena pomocí koeficientu extinkce ze standardní křivky volného koenzymu A (MP Biomedicals, OH, USA) za stejné podmínky. Je třeba poznamenat, že vzhledem k tomu, že maximální provozní teplota doporučená pro čtečku destiček je 50 °C, byl vysoce výkonný enzymový test pro CAT při zvýšených teplotách proveden pouze pro stanovení parametrů kinetiky enzymů.

výpočet kinetických parametrů pro reakční rychlosti

parametry Michaelisova-Mentenova zákona (Eq. 1) byly vypočteny pro každý enzym následujícím způsobem. Nejprve byla provedena lineární regrese na datech shromážděných ze čtečky mikrodestiček za účelem identifikace počátečních reakčních rychlostí, \(y_{i}\), při různých počátečních koncentracích substrátu, \(s_{i}\), kde i = {1,2,…, n} je počet shromážděných datových bodů. Poté byly tyto počáteční reakční rychlosti a související počáteční koncentrace substrátu pro všechny replikace současně vhodné pro Michaelis-Mentenův model (Eq. 1) použití Robustní nelineární regrese (Eq. 2) s soft-L1-loss estimator (Eq. 3) Jak je implementováno v SciPy numerical computing library v1. 2. 0 :

problém nejmenších čtverců určuje parametry \(k_{\text{M}}\) a \(v_{ \text{max} }\) minimalizací rozdílu mezi modelovými předpokládanými reakčními rychlostmi \(v_{i}\) a měřenými reakčními rychlostmi \(y_{i}\) (Eq. 2). Vyhlazovací funkce \(\rho \left( z \right)\) se používá k vytvoření nejmenšího čtvercového problému odolného vůči odlehlým hodnotám (Eq. 3). Vzhledem k nezaujaté odolnosti vůči odlehlým hodnotám a vyhýbání se chybám vyplývajícím z konvenčních linearizačních metod poskytuje robustní nelineární regrese nejpřesnější odhad parametrů pro Michaelis-Mentenův model .

výroba Isobutylacetátu v C. thermocellum

fermentace Cellobiózy

výroba Isobutylacetátu z cellobiózy v kmenech C. thermocellum byla provedena dvoustupňovou konfigurací biokonverze. Buňky byly nejprve kultivovány v MTC minimálním médiu obsahujícím 5 g / L cellobiózy v balchové trubici s gumovým uzávěrem, dokud OD nedosáhl 0,8-1.0. Buňky byly ochlazeny při pokojové teplotě po dobu 20 minut a centrifugovány při 4700×g a 4 °C po dobu 20 minut. Po odstranění supernatantu byly buňky resuspendovány ve stejném objemu čerstvého MTC minimálního média obsahujícího 2 g/L isobutanolu v anaerobní komoře. Buněčná suspenze byla poté rozdělena na 800 µL v mikrocentrifugační zkumavce se šroubovacím uzávěrem 2,0 mL s překrytím hexadekanu 200 µL. Buňky byly inkubovány při 55 °C po dobu 24 hodin a následovala analýza plynové chromatografie spojené s hmotnostním spektrometrem (GC / MS), aby se kvantifikovalo množství vyrobeného isobutylacetátu.

fermentace celulózy

pro fermentaci celulózy bylo použito modifikované MTC médium(C-MTC médium). Jako jediný zdroj uhlíku místo cellobiózy bylo použito 20 g/L Avicelu PH-101 a pro zvýšení kapacity pufru bylo přidáno 10 g / L mopů. Počáteční pH bylo upraveno na 7,5 x 5 M KOH a autoklávováno. V anaerobní komoře bylo 0,8 mL buněčné kultury přes noc naočkováno v 15,2 mL C-MTC média (inokulační poměr 1:20) se 4 mL překrytého hexadekanu. Každá zkumavka obsahovala malou magnetickou míchací tyč pro homogenizaci celulózy. Balchová trubice s gumovým uzávěrem byla inkubována ve vodní lázni spojené s regulátorem teploty nastaveným na 55 °C a magnetickým míchacím systémem. Po úpravě pH 70 µL injekce 5 M KOH bylo každých 12 hodin odebráno 800 µL buněčné kultury a 200 µL vrstvy hexadekanu. kultivační pH bylo během fermentace udržováno v rozmezí 6,4–7,8.

růst buněk byl sledován měřením proteinu pelety. Peleta celulózy z 800 µL odběrových objemů byla dvakrát promyta Mili Q vodou a suspendována 200 µL lyzačního pufru (0.2 M NaOH, 1% SDS) s následnou hodinovou inkubací při pokojové teplotě. Poté byl roztok neutralizován 50 µL 0,8 M HCl a zředěn 550 µL vody. Směs byla odstředěna při 17 000×g po dobu 3 minut. Koncentrace proteinu ze supernatantu byla analyzována bradfordovým testem kompatibilním s detergentem (Thermo Scientific, WA, USA). Zbytková peleta se vařila v peci o teplotě 98 °C po dobu jedné hodiny před kvantifikací zbytkové celulózy.

zbytková celulóza byla kvantifikována metodou kyseliny fenol-sírové s některými modifikacemi. Vařený vzorek byl dvakrát promyt vodou Milli-Q A suspendován v 800 µL vody, aby se dosáhlo ekvivalentního objemu jako originál. Vzorek byl homogenizován pipetováním a vortexováním po dobu 10 s a 20 µL homogenizovaného vzorku bylo přeneseno do nové 2,0 mL mikrocentrifugační zkumavky nebo 96jamkové desky a sušeno přes noc v peci o teplotě 55 °C. Sušená peleta byla suspendována ve 200 µL 95% kyseliny sírové a inkubována po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě. Po úplném rozpuštění pelet se přidá 20 µL 5% fenolu a smísí se s roztokem kyseliny sírové. Po 30 min inkubaci při pokojové teplotě bylo 100 µL vzorku přeneseno na novou 96jamkovou desku a byla změřena absorbance při 490 nm. Absorbance byla převedena na koncentraci celulózy standardní křivkou Avicelu PH-101 ošetřeného stejným postupem.

analytické metody

vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC)

extracelulární metabolity byly kvantifikovány pomocí vysoce výkonného systému kapalinové chromatografie (HPLC) (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 µL vzorků kultury bylo centrifugováno při 17 000×g po dobu 3 minut a poté byly supernatanty filtrovány přes 0,2 µm filtry a spuštěny s 10 mN H2SO4 mobilní fází při 0,6 mL / min na Aminex HPX-87H (Biorad Inc., CA, USA) kolona při 50 °C. detektor indexu lomu (RID) a ultrafialový detektor (UVD) při 220 nm byly použity ke sledování koncentrací cukrů, organických kyselin a alkoholů.

plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektroskopií (GC/MS)

estery byly měřeny pomocí GC (HP 6890, Agilent, CA, USA) vybavených MS (HP 5973, Agilent, CA, USA). Pro systém GC byla pro separaci analytů použita kapilární kolona Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm)a jako nosič bylo použito helium s průtokem 0,5 mL/min. Program teploty pece byl nastaven následovně: počáteční teplota 50 °C, 1 °C/min rampa až 58 °C, 25 °C/min rampa až 235 °C, 50 ° C/min rampa až 300 °C a 2-min pečení při 300 °C. 1 µL vzorkované hexadekanové vrstvy byl injektován do kolony v režimu splitless s teplotou vstřikovače 280 °C. Pro systém MS byl zvolen iontový režim (SIM) pro detekci a kvantifikaci esterů s následujícími parametry: (i) ethylacetát, m/z 45.00 a 61.00 od 4,2 do 4,6 min retenční čas (RT), (ii) isopropylacetát, m/z 45 A 102 od 4,7 do 5,0 min RT, (iii) propylacetát, m/z 59 a 73 od 5,2 do 5,8 min RT, (iv) ethyl isobutyrát, m/z 73 a 116 od 6,1 do 6,6 min RT, (v) isobutylacetát, m/z 61 A 101 od 6,6 do 7,6 min RT, (vi) butylacetát, m/z 61 a 116 od 7,7 do 9,2 min rt, (VII) isobutyl isobutyrát, m/z 89 a 129 od 10,1 do 12.5 min RT, (viii) benzylacetát, m / z 108 a 150 od 13,1 do 13,8 min RT a (ix) 2-fenethylacetát, m/z 104 a 121 od 13,8 do 15,5 min RT. jako interní standardní analyty byly použity Isoamylalkohol a isoamylacetát. Estery byly identifikovány RT a kvantifikovány špičkovými oblastmi a standardními křivkami. Standardní křivky byly stanoveny za použití čistých esterů zředěných na hexadekan v koncentracích 0,01 g / L, 0,05 g/L, 0,1 g/L, 0,5 g/L a 1 g/l