Jak provést extrakci DNA ze sušených krevních skvrn pomocí pryskyřice Chelex

každý bio-vědec, který chce analyzovat DNA, ví, že proces začíná extrakcí DNA z buněk, které jsou předmětem zájmu. Tyto buňky mohou být RBC, paraziti nebo bakterie, abychom jmenovali alespoň některé. Kromě toho existují různé metody extrakce DNA 1 z čeho vybírat v závislosti na typu vzorku, následné analýze atd. Mnoho vědců začíná se sušenými krevními skvrnami (DBS), a proto je obzvláště zajímavé, jak extrahovat DNA z těchto vzorků. DBS se běžně připravuje sběrem krve na Whatman FTA card2 nebo Whatman chromatografický 3 mm filtrační papír a před zpracováním jej nechte zaschnout po určitou dobu (~4 hodiny). Tato metoda biologického odběru vzorků se používá po celá desetiletí.

užitečná metoda pro izolaci DNA z takových vzorků za použití BT Chelex 100 Resin3 je popsána níže.

první krok: lýza erytrocytů

• vyřízněte suchou krevní skvrnu a vložte ji do mikrocentrifugační zkumavky (1,5 ml)pomocí děrovače. Nezapomeňte označit zkumavku, zejména při práci na více vzorcích. Pro účely kontroly kvality také zahrňte pozitivní kontrolní krevní skvrnu.
• přidejte 1 ml 0,5% saponinu do zkumavky obsahující krevní skvrnu. Zavřete, vířte a inkubujte při teplotě 4 0C po dobu nejméně 4 hodin, nebo ještě lépe, přes noc. V tomto kroku saponinové komplexy s cholesterolem v membráně erytrocytů vedou k tvorbě pórů v membráně a tím k hemolýze.4 Saponin je běžně používané lyzační činidlo při uvolňování parazitů (například parazitů malárie) z červených krvinek.
• odstřeďujte několik sekund při 4 000 ot / min, abyste odstranili kapky z vnitřního víka, a nasajte saponin ze zkumavky pomocí nebariérového hrotu pipety připojeného k Pasteurově pipetě na vakuovém montážním stroji. Lze také použít plastovou pasteurovou pipetu. Nechte místo v mikrocentrifuge zkumavce.

druhý krok: praní

• přidejte 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem do mikrocentrifuge, uzavřete, vířte a inkubujte při teplotě 4 0C po dobu 20-30 minut. Inkubace přes noc nezpůsobí žádnou škodu. Tento krok zajišťuje, že saponin je odstraněn z trubice.
• otáčejte několik sekund při 4 000 ot / min a poté odstraňte PBS stejným způsobem, jakým jste odstranili saponin. Nechte místo v mikrocentrifuge zkumavce.

třetí krok: extrakce DNA pomocí Chelexové pryskyřice

princip: Chelexová pryskyřice působí tak, že zabraňuje degradaci DNA z degradačních enzymů (Dnáz) a z potenciálních kontaminantů, které by mohly inhibovat následné analýzy. Obecně platí, že pryskyřice Chelex zachytí takové kontaminanty a ponechá DNA v roztoku. Chelexová pryskyřice zatýká kationty, jako je Mg2+, důležitý kofaktor pro působení Dnázy, a proto chrání DNA před degradací.5,6

• pipetujte a přidejte 150 µl 6,7% roztoku pryskyřice Chelex do zkumavky obsahující skvrnu. Zavřete trubku. Důležitá připomínka: při přípravě 6,7% roztoku Chelex použijte vodu, která neobsahuje Dnázy, nukleázy(nebo cokoli, co by mohlo poškodit a degradovat DNA).
• inkubujte při teplotě 95 0C po dobu 10 minut pomocí tepelného bloku/ třepačky. Je důležité otevřít zkumavku dvakrát, každé 2 minuty, aby se uvolnil tlak, a poté se několik sekund protřepejte. Tím se uvolňuje DNA do roztoku.

Krok čtyři: Vyhněte se kuličkám pryskyřice Chelex v konečném extraktu

• odstřeďujte po dobu 5 minut při 4 000 ot / min
• pipetujte co nejvíce extraktu do menší mikrocentrifugační zkumavky (0,6 ml)pomocí špičky bariéry aerosolu, přičemž se zabrání přenosu kuliček Chelex.
• Centrifugujte 0,6 ml mikrocentrifugy při 4 000 ot / min po dobu 10 minut. Myšlenka druhého odstřeďování je odstranit všechny zbývající chelex kuličky, které by mohly přenést do konečného extraktu. Proč je to důležité? Dva hlavní důvody: 1) Chelex se váže na ionty hořčíku (základní kofaktor pro Taq polymerázu používanou v PCR) a 2) chelex fluoresce. Pokud fluorescence je váš způsob, jak vizualizovat výsledek, to může vytvořit falešně pozitivní.
• pipetujte přibližně 100 µL a přeneste konečný extrakt do nové mikrocentrifuge. Označte a uchovávejte v chladničce.

několik tipů při provádění extrakcí DNA

• pracujte v čistém prostředí bez kontaminantů
• používejte tipy pipety, které neobsahují nukleázy
• zacházejte se všemi vzorky rukavicemi
• znovu se vyhněte chelexovým kuličkám v konečném extraktu

závěr

Chelex resin7, poskytuje jednoduchá a rychlá metoda extrakce DNA z DBS, pro použití v různých molekulárně analytických aplikacích. Tato metoda nevyžaduje drahé vybavení a je spolehlivá při testování proti jiným metodám.

1. GE Healthcare (2010). Spolehlivá extrakce DNA z karet Whatman FTA. Poznámka k použití 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Spojené království: GE Healthcare.
2. Whatman (n. d.). Příprava disku FTA pro analýzu DNA. Whatman FTA protokol BD08.
3. Bio-Rad (ND) Chelex® 100 a Chelex 20 chelatační iontoměničová pryskyřice návod k použití. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad Laboratories.
4. Baumann, e., Stoya, G., Völkner, a., Richter, W., Lemke, C., and Linss, W. (2000). Hemolýza lidských erytrocytů se saponinem ovlivňuje membránovou strukturu. Acta Histochemica, 102 (1), 21-35.
5. IBRC (2016). Extrakční Protokol: Chelex. Web IBRC. Citováno z http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C.S., Boissaye, R., Stewart, J., and Staton, P. (n. d.). Vývoj a interní validace protokolu extrakce DNA Chelex ® pro referenční perorální výtěry.
7. Walsh, P. S., Metzger, D. A., and Higuchi, R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 jako médium pro jednoduchou extrakci DNA pro PCR typizaci z forenzního materiálu. Biotechniques, 54 (3), 134-139.