pruhování a malování chromozomů
přípravky chromozomů kostní dřeně 107 případů s myeloidními poruchami byly analyzovány pomocí G bandingu, aby se vyhodnotilo velikost delece dlouhého ramene chromozomu 20. Jak již bylo popsáno (Načeva et al., 1995b) byly identifikovány dvě kategorie delece 20q-velké delece (59 případů), což mělo za následek ztrátu obou tmavých pásů Giemsa z 20q (obrázek 1a, horní) a malé delece (48 případů), ve kterých zůstává jeden tmavý pás Giemsa (obrázek 1a, spodní). Dále jsme se zaměřili na druhou skupinu pacientů (shrnuto v tabulce 1).
analýza 20Q delecí pomocí G-bandáže, lakování chromozomů a sond specifických pro lokus. (a) G pruhovaný parciální karyotyp normálního (levého) a odstraněného (pravého) chromozomu 20 homologů vykazující velkou deleci (horní pár) a malou deleci (spodní pár) dlouhého ramene. b) metafázová buňka kostní dřeně hybridizovaná s chromozomem 15 (červený) a chromozomem 20 (zelený) barvy prokazující, že markerový chromozom (šipka) identifikovaný pásem G jako del (20) (q11) je ve skutečnosti odvozen z chromozomu 15. (c) metafázová buňka kostní dřeně hybridizovaná barvou chromozomu 20 (červená) prokazující přítomnost kryptické translokace zahrnující chromozom 20 (šipka), která byla identifikována jako del(20q) pomocí G bandáže. (d) metafázová buňka kostní dřeně od pacienta s Del(20) (q11.2q13.2) hybridizovanou barvou chromozomu 20, která ukazuje hybridizaci pouze na oba homology chromozomu 20. (e) částečná metafázová buňka kostní dřeně od pacienta s MDS DB122 hybridizovaná centromerní sondou chromozomu 20 (červená) a pac dJ620E11 (zelená) ukazující hybridizaci PAC dJ620E11 k normálním i odstraněným homologům chromozomu 20. (f) částečná metafázová buňka kostní dřeně od pacienta DB122 hybridizovaná centromerní sondou chromozomu 20 (červená) a pac dJ661I20 (zelená) ukazující nepřítomnost zeleného signálu na del (20) (q11. 2q13. 1) (šipka). (g) částečná metafázová buňka kostní dřeně pacienta s MDS DB214 hybridizovaná centromerní sondou chromozomu 20 (červená) a pac dJ242A14 (zelená). Všimněte si nepřítomnosti zeleného signálu na del (20) (q11. 2q13. 1) (šipka). (h) částečná metafázová buňka kostní dřeně od pacienta s MDS DB214 hybridizovaná centromerní sondou chromozomu 20 (červená) a pac dJ196H17 (zelená) ukazující přítomnost červených a zelených signálů na normálních i odstraněných homologech chromozomu 20 (šipka
analýza ryb pomocí chromozomu 20 barva byla provedena na 48 vzorky s malou delecí 20q. V šesti případech bylo „20Q delece“ odhaleno kvůli záhadným přeskupením. V jednom případě současná aplikace barev pro chromozomy 15 a 20 identifikovala marker odvozený od chromozomu 15, ale dva normální homology chromozomu 20 (obrázek 1b). Ve zbývajících pěti případech prokázalo malování chromozomů přítomnost nevyvážené translokace s opakujícím se bodem zlomu na 20q11. 2 a variabilními partnery chromozomů (obrázek 1c). Ve všech pěti případech byl marker der(20) jediným translokačním produktem zachovaným v genomu. Mapování ryb dále ukázalo, že bod zlomu na chromozomu 20 se vyskytl v oblasti proximální k D20S107 a potvrdil ztrátu zbytku dlouhého ramene chromozomu 20 (údaje nejsou zobrazeny). Tyto výsledky budou podrobně popsány jinde.
ve zbývajících 42 případech bylo malování chromozomů v souladu s malou intersticiální delecí 20q (obrázek 1d). Většina (33 případů) nesla 20Q deleci jako jedinou karyotypovou abnormalitu. Ve zbývajících devíti případech byla delece 20q doprovázena různými dalšími chromozomálními aberacemi(Tabulka 1). Všech 42 případů s malou delecí 20q bylo podrobeno dalšímu mapování ryb pomocí sond specifických pro lokus.
deleční mapovací analýza
42 pacientů s malými delecemi 20q bylo analyzováno pomocí FISH za použití centromerního PAC (CEP20), PAC hybridizujícího do distální oblasti 20q (LSI 20q13) a Pac hybridizujícího v rámci CDR (LSI D20S108). U každého pacienta byly na odstraněném chromozomu 20 pozorovány signály z LSI 20q13 i CEP20, nikoli však LSI D20S108, které potvrzují přítomnost intersticiální delece (shrnuto na obrázku 3). Metafáze od každého pacienta byly poté hybridizovány s mapováním PACs na hranicích známých MPD a MDS / AML CDRs–D20S107, které leží na proximální hranici cdr a D20S176, která leží telomericky distální hranice cdr (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).
přehled mapových dat. Tento obrázek představuje výsledky PCR ryb a mikrosatelitů, které umožňují vymezení nových cdr MDS / AML a MPD. Pacienti byli analyzováni pomocí FISH s lokusovými specifickými sondami s výjimkou pacienta RB42, u kterého byla provedena mikrosatelitní PCR. Mikrosatelitní PCR byla dříve prováděna u pacientů MH40 a JH41 (Bench et al ., 1998a). Vlevo jsou zobrazeny značky STS a odpovídající PACs. Je uvedena vzdálenost mezi značkami v megabasepairs nebo centiMorgans. Značky v závorkách jsou odděleny méně než 0,1 Mb. Distální hranice MPD CDR byla dříve hlášena (Wang et al ., 1998). MDS / AML CDR je lemován PACs dJ620E11 a dJ196H17. MPD CDR je lemováno DS20S108 a D20S481. Pacient DB214 také vykazoval retenci PACs dJ149D20 (D20S481), dJ81O8 (D20S454), dJ207N8 (stSG34079) a dJ734B23 (WI-4255) (údaje nejsou zobrazeny)
u 37 pacientů (25 s MDS nebo AML, 12 s MPD) obě sondy nedokázaly vytvořit signál na odstraněném chromozomu 20 prokazující přítomnost rozsáhlých delecí, které by nepomohly upřesnit cdr. Tyto vzorky nebyly dále zkoumány. U čtyř pacientů s MDS (DB53, MH40, DB122 a DB214) a u jednoho s MPD (JH41) však jedna ze dvou sond vydala signál na odstraněném chromozomu 20 a tyto vzorky byly podrobněji analyzovány.
kromě 42 pacientů s malými 20Q delecemi, které byly analyzovány pomocí FISH s použitím lokusových specifických sond, bylo dalších šest pacientů s 20Q delecí (čtyři s MDS, dva s MPD), u nichž nebyly k dispozici metafázy kostní dřeně, analyzováno pomocí mikrosatelitové PCR. DNA z purifikovaných granulocytů a T buněk byla analyzována pomocí velkého panelu polymorfních markerů, které pokrývaly cdr MPD a MDS/AML (Tabulka 2). Všichni čtyři pacienti s MDS měli delece přesahující hranice zveřejněné CDR. U jednoho ze dvou pacientů s MPD (RB42) však centromerní hranice delece značně snížila MPD CDR (Obrázek 2, Tabulka 2).
Mikrosatelitní výsledky PCR, které definují proximální hranici nové společné odstraněné oblasti MPD. Mikrosatelitní PCR byla provedena za použití indikovaných markerů na DNA extrahované z purifikovaných granulocytů (G) A T buněk (T) od pacienta RB42. Šipky označují horní pásmo každé alely. Otevřené šipky označují alelu, která je odstraněna v granulocytech. Dvě alely jsou zachovány na D20S108, zatímco jedna alela je ztracena na D20S858 a D20S46
snížení společné odstraněné oblasti u pacientů s MDS/AML
předběžná analýza FISH identifikovala čtyři pacienty s MDS s delecemi, které zasahovaly do CDR MDS/AML. V každém případě byla delece 20q přítomna ve všech zkoumaných metafázách. Ve třech případech (DB53, DB214 a MH40) byla delece 20q přítomna jako jediná abnormalita. U pacienta DB122 byla delece 20q původní jedinou abnormalitou se dvěma subklonami obsahujícími kromě delece 20q také trizomii 21 nebo trizomii 8 a trizomii 21. Tyto čtyři případy byly studovány pomocí dalších sond specifických pro lokus, aby se zjistily hranice delece.
proximální hranice MDS / AML CDR byla vylepšena pacienty DB53, MH40 a DB122. Proximální hranice delece v DB53 ležela mezi D20S107 a WI-11538 (obrázek 3), vzdálenost přibližně 400 kb. U pacienta MH40 PAC obsahující WI-11538 (dJ357E14) trvale vedl ke snížení signálu v souladu s přítomností bodu proximální delece v tomto PAC (obrázek 3). Dále proximální hranice delece u pacienta DB122 ležela mezi sts-R52161 a stSG25449 (obrázek 1e, f), vzdálenost menší než 200 kb (obrázky 3 a 4). To představuje velké zdokonalení proximální hranice MDS / AML CDR.
souhrn-bakteriální klon contig. Tento obrázek ilustruje reprezentativní vzorek klonů PAC a BAC, které tvoří contig. Klony, které jsou součástí cesty obkladů používané pro sekvenování, jsou zobrazeny v normálním typu. MDS / AML CDR pokrývá oblast 2.6 Mb mezi dJ620E11 a dJ196H17, zatímco MPD CDR sahá od D20S108 do D20S481, vzdálenost 2.7 Mb. Oblast překrytí mezi dvěma cdr má velikost 1,7 Mb. Ne všechny PACs, BACs a markery jsou uvedeny. Část kompletní mapy mezi dJ128O17 a dJ272H18 je zobrazen. Kompletní mapu si můžete prohlédnout na http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_20ctg125& class=Map
pacient DB214 umožnil značné upřesnění distální hranice MDS / AML CDR. Distální hranice tohoto odstranění ležela mezi WI-12515 a stSG40369 (obrázek 1g, h), vzdálenost menší než 100 kb (obrázky 3 a 4).
tyto údaje proto značně redukují MDS / AML CDR na oblast ležící mezi PAC dJ620E11, která obsahuje sts-R52161, a pac dJ196H17, která obsahuje WI-12515 (obrázky 3 a 4). Bakteriální klon contig uvedený níže ukazuje fyzickou velikost této oblasti přibližně 2, 6 Mb.
snížení společné odstraněné oblasti u pacientů s MPD
u pacienta JH41 (diagnóza PV)byla proximální hranice delece dříve stanovena mikrosatelitovým PCR, aby ležela mezi D20S438 a D20S107 (Bench et al ., 1998a). PAC dJ155H19, který obsahuje D20S107 (obrázek 4), trvale vedl ke snížení signálu v souladu s přítomností bodu proximální delece v tomto PAC (obrázek 3).
granulocyty a T buňky od dvou dalších pacientů byly zkoumány pomocí mikrosatelitové PCR (Tabulka 2). Jeden pacient s PV (RB42) prokázal retenci heterozygotnosti na d20s108, ale ztrátu na D20S858 (Obrázek 2, Tabulka 2). Proximální zarážka delece u tohoto pacienta ležela mezi D20S108 a D20S858, vzdálenost menší než 200 kb (obrázky 3 a 4).
tyto údaje výrazně snižují MPD CDR, které je nyní lemováno d20s108 (tato studie) a D20S481 (Wang et al ., 1998). Odhadovaná fyzická velikost této oblasti je 2.7 Mb, s využitím dat z bakteriálního klonu contig uvedeného níže. Oblast překrytí mezi novými MDS / AML a MPD cdr definovala kombinovanou „myeloidní“ CDR 1,7 Mb (obrázek 3).
bakteriální klon contig pokrývající společné odstraněné oblasti MPD a MDS/AML
dříve jsme vytvořili 11 Mb YAC contig této oblasti chromozomu 20 (Bench et al ., 1998a). Za účelem vytvoření podrobnější fyzické mapy, nyní jsme vytvořili souvislou mapu založenou na PAC a BAC. Klony PAC a BAC byly identifikovány hybridizací STSs do genomických knihoven (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Klony se překrývaly pomocí restrikčních otisků prstů (Gregory et al ., 1997) a mapování obsahu STS umožňující seskupení klonů do spojů. K překlenutí spojů byly pro další screening knihovny použity nové STSs a DNA sondy, vyvinuté z konců spojů. Nové PACs a BACs byly poté sloučeny do souvislostí stejným způsobem, dokud nebyla vytvořena souvislá mapa.
bakteriální klon contig obsahuje celkem 456 bakteriálních klonů, z nichž 376 jsou PACs a 80 jsou BACs. Rozkládá se od D20S607 po SEMG1 a zahrnuje 202 DNA markerů, z nichž 185 jsou STSs a 17 jsou DNA sondy. Velikost contigu byla založena na průměru 3, 5 kb Na pásmo otisků prstů HindIII (P Deloukas (2000), nepublikované výsledky). Odhadovaná velikost contigu byla vypočtena jako 5 Mb vynásobením celkového počtu různých pásem otisků prstů v contig 3,5. Znázornění mapy ilustrující minimální cestu obkladů a PACs, které byly použity pro experimenty s rybami, je znázorněno na obrázku 4. Plná verze mapy lze nalézt na http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name = Chr_-20ctg125&class=Map.
identifikace exprimovaných sekvencí
čtyřicet tři jedinečných Estů bylo umístěno mezi d20s607 a stSG34035 včetně. Z toho 34 est bylo zmapováno hybridizací na „polygrid“ PACs a BACs nebo kolonií PCR bakteriálních kolonií obsahujících PACs nebo BACs (obrázek 4). Dalších devět est, dříve mapovaných v této oblasti chromozomu 20 (Bench et al ., 1998a; Deloukas et al. , 1998) byly umístěny na contig výbuchem zarovnání est sekvence s dostupnou PAC nebo BAC genomové sekvence.
za účelem identifikace domnělých nových exprimovaných sekvencí bylo 23 klonů PAC z minimální cesty obkladů částečně nebo úplně sekvenováno. Genomová sekvence těchto klonů byla analyzována pomocí programu NIX (Williams et al., 1998), který umožňuje současné pozorování řady nástrojů pro identifikaci genů, včetně GRAIL, GENSCAN a BLAST. Bylo identifikováno osm dříve nemapovaných Est a genů(Tabulka 3). Šest z nich leželo v MPD CDR a sedm leželo v MDS CDR. Byly získány důkazy, že šest z těchto osmi domnělých exprimovaných sekvencí představovalo bona fide transkribované geny, spíše než zpracované pseudogeny nebo genomové kontaminanty DNA v databázi EST. Kcns1 je gen, který kóduje podjednotku kanálu řízeného draslíkem. Následně bylo zjištěno, že ESTs AA053206/AA053121 jsou odvozeny z genu SGK2 (Kobayashi et al ., 1999). Zarovnání sekvence cDNA s genomovou sekvencí prokázalo strukturu exon / intron pro tři ze zbývajících šesti Estů (AI312497 ,AA568401 a AA910031) se sekvencí konsensu v místě spojení přítomnou na všech hranicích exon/intron. Ve všech třech těchto případech byla přítomnost každého exonu potvrzena predikčními programy exon, jako je grál. Existenci exonu předpovídali také GRAIL, GENSCAN a Genefinder v oblasti PAC dJ1108D11, což odpovídá est AA993161, což znamená, že tento est také představoval transkribovaný gen.
sekvenční analýza PACs z minimální cesty obkladů nám také umožnila stanovit genomickou strukturu známých a nových genů v této oblasti. Zarovnání RPTPrho cDNA na PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 a dJ269M15 prokázalo, že tento gen pokrývá alespoň 1,2 Mb. PAC dJ138B7 obsahoval dva geny (h-l(3)mbt a SGK2) a také 5 ‚ část genu odpovídající SHGC-36858. Zejména Gen H-l (3)mbt obsahuje 20 exonů se dvěma domnělými alternativními konečnými exony. Analýza dJ644L1 ukázala, že lidský gen MafB se skládá z jediného exonu. Analýza dokončené sekvence byla také provedena Sangerovým centrem (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) a to lze zobrazit na http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20& class=GenomeSequence.
tyto údaje prokazují přítomnost šesti genů a dalších 14 hodnot unqiue v rámci nové MDS / AML CDR a celkem 14 genů s 23 jedinečnými hodnotami v rámci nové MPD CDR (Tabulka 3). Šest genů a 10 jedinečných Estů je přítomno v oblasti překrytí mezi dvěma cdr.
profilování exprese
předpokládá se, že myeloproliferativní poruchy, myelodysplastické syndromy a akutní myeloidní leukémie jsou výsledkem transformace multipotentní buňky v kompartmentu hematopoetických kmenových buněk (Bonnet a Dick, 1997; Kralovics a Prchal, 1998). Kromě toho bylo dříve prokázáno, že delece 20q může vzniknout v progenitorové buňce schopné vést jak k myeloidním buňkám,tak k b buňkám (White et al ., 1994). Tyto úvahy naznačují, že gen nebo geny na chromozomu 20q, které jsou inaktivovány u těchto onemocnění, jsou pravděpodobně exprimovány v normálních hematopoetických progenitorových buňkách. Proto jsme určili, která z transkribovaných sekvencí byla exprimována v kostní dřeni a purifikovaných CD34 pozitivních buňkách.
zesílení reverzní transkripce PCR (RT–PCR) bylo provedeno s primery představujícími každou z 51 transkribovaných sekvencí (obrázek 5). Pro každou transkribovanou sekvenci byly provedeny alespoň dvě nezávislé RT-PCR amplifikace. Jako pozitivní kontrola byly použity primery odpovídající EST (WI-7685) odvozené z 3′ UTR genu CD34 (obrázek 5). Tam, kde dva nebo více Estů odpovídalo stejné transkribované sekvenci, byl pro každý EST dosažen stejný výsledek.
expresivní analýza genů v rámci contig. Data RT-PCR jsou zobrazena pro tři est markery v rámci contig (AI312497, stSG3032, AA716165)a pro WI-7685, EST odvozený od 3 ‚ UTR genu CD34. RT-PCR byla provedena pomocí RNA odvozené z buněk kostní dřeně dvou normálních jedinců (BM) nebo z CD34 pozitivních buněk dalšího normálního jedince (CD34+). Jsou uvedeny velikosti produktů PCR. M, ΦX174 / HaeIII digest; + RT, reverzní transkripce prováděná v přítomnosti reverzní transkriptázy − – RT, mock reverzní transkripce prováděná bez reverzní transkriptázy − – ve, PCR nastavená bez DNA; +ve, PCR nastavená pomocí genomické DNA
údaje jsou uvedeny na obrázku 5, v tabulkách 3 a 4. Z 37 exprimovaných sekvencí v MPD CDR bylo 20 exprimováno v mononukleárních buňkách kostní dřeně. Z toho 16 bylo také exprimováno v CD34 pozitivních buňkách. V rámci MDS / AML CDR bylo 11 z 20 transkribovaných sekvencí exprimováno v mononukleárních buňkách kostní dřeně. Z toho osm bylo také exprimováno v CD34 pozitivních buňkách. Ze 16 transkribovaných sekvencí, které leží v oblasti překrývání mezi MPD a MDS / AML cdr, bylo osm exprimováno v buňkách kostní dřeně, z nichž pět bylo také exprimováno v CD34 pozitivních buňkách. Těchto pět transkribovaných sekvencí proto představuje primární kandidátní geny, protože leží jak v MPD, tak v cdr MDS/AML a jsou exprimovány v kompartmentu hematopoetických progenitorových buněk. Zahrnují dva neznámé geny odpovídající ESTs SHGC-36858 a WI-12515, stejně jako tři geny, SFRS6, h-l (3)mbt a MYBL2.