Clemizol a modulátory serotoninové signalizace potlačují záchvaty u Dravetova syndromu

Abstrakt

Dravetův syndrom je katastrofická dětská epilepsie s časnými záchvaty, zpožděným vývojem jazyka a motoriky, poruchami spánku, úzkostným chováním, závažným kognitivním deficitem a zvýšeným rizikem úmrtí. Je primárně způsobena de novo mutacemi genu SCN1A kódujícího neuronální napěťově aktivovaný sodíkový kanál. Zebrafish s mutací v homologu SCN1A rekapituluje spontánní záchvatovou aktivitu a napodobuje konvulzivní pohyby chování pozorované u Dravetova syndromu. Tady, ukážeme, že fenotypový screening knihoven léčiv u mutantů scn1 zebrafish rychle a úspěšně identifikuje nová terapeutika. Prokazujeme, že klemizol se váže na serotoninové receptory a jeho antiepileptická aktivita může být napodobena léky působícími na signalizační dráhy serotoninu, např. Shodně s těmito nálezy zebrafish jsme léčili pět lékařsky neřešitelných pacientů s Dravetovým syndromem s klinicky schváleným agonistou serotoninového receptoru (lorcaserin, Belviq®) a pozorovali některé slibné výsledky, pokud jde o snížení frekvence záchvatů a/nebo závažnosti. Naše zjištění ukazují rychlou cestu od preklinického objevu u zebrafish, přes identifikaci cíle, k potenciální klinické léčbě Dravetova syndromu.

Úvod

dětské epilepsie klasifikované jako katastrofické jsou často spojeny s genetickou mutací. Mezi nimi byl Dravetův syndrom spojen s více než 600 de novo mutacemi v jediném genu, SCN1A (Catterall et al ., 2010; Escayg a kol., 2010). Děti trpící Dravetovým syndromem vykazují záchvaty již ve věku 6 měsíců, zpožděný jazykový a motorický vývoj, poruchy spánku, úzkostné chování a závažný kognitivní deficit (Dravet, 2011). Byly také hlášeny příznaky poruchy autistického spektra (Li et al ., 2011) a riziko náhlé nevysvětlitelné smrti s epilepsií (SUDEP) v této populaci se odhaduje na 15krát vyšší než u jiných dětských epilepsií (Kearney, 2013). Dostupné antiepileptika nenabízejí adekvátní kontrolu záchvatů a resektivní neurochirurgické postupy nejsou běžně možností. Nová léčba Dravetova syndromu zůstává důležitou neuspokojenou potřebou i přes určitou úroveň účinnosti v omezených klinických studiích s kanabidiolem (Epidiolex®) a stiripentolem (Diacomit®), které mohou být spojeny s kognitivními nebo chuť k jídlu bezpečnostní obavy (Perez et al., 1999; Chiron a kol., 2000; Detyniecki a kol., 2016; Devinsky a kol., 2016).

mutace v SCN1A, genu kódujícím α-podjednotku tvořící póry napěťově řízeného sodíkového kanálu (Nav1. 1), byly identifikovány u téměř 85% pacientů s Dravetovým syndromem (Dravet, 2011). Kanály Nav1.1 přispívají k rychlé depolarizaci neuronálních membrán pozorovaných během generování akčního potenciálu (Hodgkin et al., 1952). U myší heterozygotních pro mutaci ztráty funkce v Nav1. 1 se na počátku života vyvinou spontánní záchvaty citlivé na teplotu a předčasně zemřou kolem postnatálního dne 25 (Yu et al ., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Akutní elektrofyziologické studie u těchto a souvisejících myší s deficitem Scn1a naznačují snížení hustoty proudu sodíku a související snížení aktivity vypalování pro subpopulaci inhibičních neuronů exprimujících GABA (ale ne excitačních hlavních buněk), které vyvrcholily sníženou synaptickou inhibicí a hyperexcitabilitou sítě (Yu et al ., 2006; Kalume a kol., 2007; Han et al., 2012). Tato hypotéza „interneuronopatie“ je v souladu s jinými formami katastrofických dětských epilepsií a byla potvrzena u myší, kde byl Scn1a selektivně odstraněn z parvalbumin-nebo somatostatin-exprimujících interneuronových subpopulací (Dutton et al ., 2013; Tai et al., 2014). U těchto myší bylo také hlášeno autistické chování (Han et al ., 2012). Zajímavé je, že počáteční studie o lidských excitačních a inhibičních neuronech odvozených pomocí indukované technologie pluripotentních kmenových buněk od dvou pacientů s Dravetovým syndromem uváděly deficity napěťově aktivovaného sodíkového proudu pro oba typy buněk, což naznačuje buď homeostatickou kompenzaci časné ztráty funkce kritického mozkově specifického sodíkového kanálu, nebo další mechanismy přispívající k epileptickému fenotypu pozorovanému u těchto pacientů (Jiao et al., 2013; Liu a kol., 2013).

ačkoli myši a lidské indukované neurony odvozené z pluripotentních kmenových buněk přispívají k našemu pochopení základní patofyziologie Dravetova syndromu, tyto systémy nejsou vhodné pro rychlou identifikaci nových terapií kvůli variabilitě těchto modelů a reprodukovatelnosti kvantitativních měření. Vzhledem k tomu, zebrafish jsou ideální obratlovců modelový systém pro provádění malých molekul fenotypu na bázi obrazovky (MacRae et al ., 2015), a jsou přístupné genetickým manipulacím, zaměřili jsme naše úsilí na mutanta sodíkového kanálu zebrafish. Mutanti Zebrafish, kteří mají mutaci missense se ztrátou funkce v orthologue SCN1A, scn1Lab, byli identifikováni na obrazovce mutageneze (Schoonheim et al ., 2010). Vzhledem k duplikaci celého genomu předků jsou mutanty scn1lab zebrafish haploinsufficient pro Nav1. 1 a analogické scn1a + / – myším nebo pacientům s Dravetovým syndromem. Konvulzivní chování a epizody krátkého interiktálního a dlouhodobého polyspike iktálního elektrografického výboje jsou pozorovány u mutantních larev již 3 dny po oplodnění (dpf)s progresí k robustnějším záchvatovým fenotypům mezi 4 a 7 dpf (Baraban et al ., 2013; Hong a kol., 2016). Mutantní larvy umírají předčasně, vykazují metabolické deficity (Kumar et al ., 2016) a jsou rezistentní na mnoho antiepileptik (AED) (Dinday et al., 2015). Podobně jako u klinické léčby Dravetova syndromu lze určité útlum záchvatové aktivity dosáhnout valproátem, benzodiazepiny, bromidy, stiripentolem a ketogenní dietou (Baraban et al., 2013). Pomocí scn1Lab mutant zebrafish larev a dvoustupňové screeningové strategie založené na fenotypu jsme nyní prověřili více než 2300 sloučenin. Klemizol, antagonista histaminového receptoru (H1) první generace, byl identifikován jako silný inhibitor behaviorální a elektrografické záchvatové aktivity (Baraban et al., 2013). Antihistaminika jsou však kontraindikována u pediatrických populací epilepsie (Miyata et al ., 2011) a analog H1 receptoru u zebrafish vykazuje méně než 50% podobnost s člověkem (Peitsaro et al ., 2007). Zde používáme preklinické modely zebrafish, abychom prokázali, že clemizol, ale ne antihistaminika, vykazují antiepileptickou aktivitu. Na základě vazby ligandu a dalšího cíleného screeningu léků v scn1 mutant zebrafish jsme identifikovali několik serotoninových (5-HT) modulátorů jako účinných při potlačování záchvatů, včetně dvou (trazodon a lorcaserin) sloučenin schválených FDA. Lorcaserin (Belviq®) byl předepsán v rámci programu compassionate use dětem s Dravetovým syndromem a u některých pacientů vedl ke snížení záchvatové aktivity. Navrhujeme, aby modulace 5-HT signalizace představuje nový terapeutický zásah pro tuto katastrofickou dětskou epilepsii.

materiály a metody

údržba Zebrafish

monitorování záchvatů

u 5 dpf byly jednotlivé larvy zebrafish umístěny do jediné jamky čiré 96jamkové mikrodestičky obsahující embryonální média s plochým dnem. Larvy byly vybrány náhodně, protože určení pohlaví není v této fázi možné. Mikrodestičky byly umístěny uvnitř zařízení pro sledování pohybu DanioVision a aklimatizovány po dobu 20 minut při pokojové teplotě. Lokomotivní grafy byly získány pro každou jamku během záznamové epochy 10 min pomocí systému DanioVision se softwarem EthoVision XT (DanioVision, Noldus Information Technology); nastavení detekce prahu pro identifikaci objektů tmavších než pozadí bylo optimalizováno pro každý experiment. Hodnocení záchvatů bylo provedeno pomocí následující třístupňové stupnice stanovené pro záchvaty vyvolané pentylenetetrazolem (Baraban et al ., 2005): fáze 0, žádná nebo velmi malá plavecká aktivita; Fáze I, zvýšená, krátké záchvaty plavecké aktivity; fáze II, rychlé „vířivé“ krouživé plavání; a fáze III, paroxysmální křeče podobné klonu celého těla a krátká ztráta držení těla. Ryby divokého typu jsou obvykle hodnoceny ve fázi 0 nebo i. Grafy byly analyzovány pro ujetou vzdálenost (v milimetrech) a střední rychlost(v milimetrech za sekundu). Jak bylo uvedeno dříve (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), změny rychlosti byly nejcitlivějším testem záchvatového chování.

pro elektrofyziologické studie byly larvy zebrafish krátce paralyzovány α-bungarotoxinem (1 mg/ml) a imobilizovány v 1, 2% agarose; záznamy lokálního potenciálu pole byly získány ze struktur předního mozku pomocí techniky s jednou elektrodou, jak bylo dříve popsáno (Baraban et al., 2005; Hong a kol., 2016). Pro každou rybu při 1 kHz byly získány relace záznamu potenciálu místního pole vložené do agarosy 10 na 30 min. Systém iZAP (Hong et al., 2016) byl použit pro dlouhodobé neinvazivní sledování zebrafish v nepřítomnosti paralyzujícího činidla. Systém autonomně zachycuje několik larev zebrafish pod několika integrovanými povrchovými elektrodami v mikrofluidních komorách. larvy scn1Lab byly nepřetržitě monitorovány po dobu 5 hodin. potenciál elektrického pole byl zaznamenáván při 1 kHz nepřetržitě s výjimkou 2-až 3-min přestávek pro změnu média pro ošetření a mytí sloučenin. Zaznamenaná data byla analyzována pomocí MATLABu pro grafy potenciálu pole a frekvenční analýzu.

screening složené knihovny

sloučeniny pro screening léků byly zakoupeny od Selleck Chemicals a byly poskytnuty jako 10 mM DMSO roztoky. Pro screening byla použita selleckova Knihovna ligand s iontovým kanálem (Katalog #L2700), složená knihovna GPCR (Katalog #L2200) a přizpůsobená 5-HT modulační knihovna. Knihovní sloučeniny jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. Na všech obrazovkách knihovny léčiv byly sloučeniny kódovány a experimenty byly prováděny vyšetřovateli, kteří byli slepí k povaze sloučeniny. Základní záznamy lokomočního chování byly získány z mutantů v embryonálním médiu, jak je popsáno výše; druhý lokomoční Graf byl poté získán po změně roztoku na zkoušenou sloučeninu a rovnovážném období 20 min. Sloučeniny pro studie lokomoce byly rozpuštěny v embryonálním médiu a byly testovány v koncentraci 250 µM s konečnou koncentrací DMSO 2,5%.

kritéria pro určení pozitivního nálezu byla následující: i) snížení průměrné rychlosti o ≥40% a ii) snížení chování záchvatů na stupeň 0 nebo stupeň I v lokomoce nejméně u 50% testovaných ryb. Každá zkoušená sloučenina klasifikovaná jako „pozitivní hit“ v testu lokomoce byla hodnocena na toxicitu přímou vizualizací na stereomikroskopu po 90 min expozici léku. Toxicita (nebo mortalita) byla definována jako žádný viditelný srdeční rytmus nebo pohyb v reakci na vnější stimulaci u nejméně 50% testovaných ryb. Hyperexcitabilita byla definována jako sloučenina způsobující ≥40% zvýšení rychlosti plavání a / nebo záchvatové aktivity stadia III u nejméně 50% testovaných ryb. Pozitivní zásahy zjištěné na primární obrazovce lokomoce byly potvrzeny pomocí metody screeningu lokomoce ve druhém testu s nezávislou spojkou zebrafish. Sloučeniny byly poté zakoupeny odděleně od Sigma-Aldrich a potřetí testovány metodou screeningu lokomoce na nezávislé spojce zebrafish. Léky, které snížily průměrnou rychlost plavání nad prahovou hodnotu a byly netoxické ve třech nezávislých testech lokomoce, byly dále analyzovány pomocí elektrofyziologického testu. V elektrofyziologických studiích byly léky nejprve potvrzeny v koncentraci 250 µM pomocí lokomočního testu a poté byl stejný zebrafish hodnocen pomocí lokálního záznamu potenciálu pole. Veškerý screening byl proveden s kódovanými sloučeninami a analyzován vyšetřovateli zaslepenými identitou sloučeniny.

fylogenetická analýza

fylogenetická analýza lidských htr2 a htr2 proteinových sekvencí zebrafish byla provedena pomocí softwaru PhyML v rámci testovacích parametrů pravděpodobnostního poměru SH (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al ., 2008). Proteinové sekvence byly odvozeny ze sekvencí Ensembl human HTR2A (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) a zebrafish htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ENSDART00000104569), htr2cl1 (ENSTART00000024191).

kvantitativní analýza exprese mRNA v reálném čase

hladiny exprese genů zebrafish htr2 byly zkoumány pomocí RNA sdružené z 25 hlav nebo ocasů z 5 dpf divokých nebo scn1Lab homozygotních mutantních larev a pitvaných mozků z jednotlivých dospělých samců zebrafish divokého typu. Celková RNA byla extrahována pomocí činidla TRIzol® (Invitrogen) podle protokolu výrobce a ošetřena Dnázou I (Invitrogen). Purifikovaná mRNA byla retrotranscribována na cDNA pomocí systému syntézy prvního řetězce SuperScript®III (Invitrogen)se směsí oligo (dT)20. Hladiny exprese genů htr2 zebrafish a eukaryotický translační elongační faktor 1 alfa 1, jako 1 (eef1a1l1), byly stanoveny pomocí PCR stroje StepOne™ v reálném čase (Applied Biosystems). Reakce byly provedeny ve 20 µl objemech na 96 jamkových deskách pomocí SYBR®Green Master Mix (Applied Biosystems), s 250 nM primerem a 3 µl cDNA. Oligonukleotidové sekvence jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Data byla analyzována ze tří nezávislých experimentů. Data byla vyjádřena jako hodnoty Ct a použita k určení hodnot ΔCt.

studie na lidech

po úspěšné identifikaci sloučenin v našem modelu zebrafish a zvážení farmakokinetiky byly dětem předepsány Belviq® (lorcaserin) podle protokolu o soucitném použití v dětské nemocnici Colorado (IND 125307). Děti se kvalifikovaly pro použití přípravku Belviq®, pokud měly mutaci SCN1A nebo klinickou diagnózu Dravetova syndromu, a v některých případech selhaly alespoň dva léky včetně stiripentolu a s výjimkou blokátorů sodíkových kanálů. Děti byly povinny mít elektrokardiogram a echokardiogram na začátku léčby a každých 6 měsíců během používání přípravku. Kromě toho byli povinni provádět následné návštěvy každé 3 měsíce, aby zajistili přiměřený růst, a také posoudit další vedlejší účinky. Laboratorní vyšetření bylo vyžadováno každých 6 měsíců, aby zahrnovalo hematologické vyšetření, vyšetření jaterních funkcí a vyšetření renálních funkcí. Dávka přípravku Belviq® byla zahájena dávkou 2, 5 mg před spaním a podle potřeby se postupně zvyšovala týdně na maximální dávku 10 mg dvakrát denně nebo 0, 3 mg/kg/den—podle toho, co nastane dříve.

pro retrospektivní sběr dat včetně vzdání se souhlasu bylo získáno schválení institucionální revizní komise. Data byla získána ze retrospektivního přehledu elektronických lékařských záznamů v dětské nemocnici Colorado včetně věku, typů záchvatů a frekvence před a po použití přípravku Belviq®, nežádoucích účinků, dávky přípravku Belviq® a souběžného užívání léků.

Statistická analýza

údaje jsou prezentovány jako střední ± standardní chyba průměru (SEM), pokud není uvedeno jinak. Pro srovnání dvou skupin byl použit Studentův t-test. Pokud rozptyl neměl normální rozdělení, byl použit neparametrický Mann-Whitneyho u-test. Jednosměrná ANOVA po Dunnettově vícenásobném srovnávacím testu pro analýzu proti kontrolnímu vzorku nebo Holm-Sidakově několikanásobném srovnání mezi prostředky. Rozdíly považované za statisticky významné jsou označeny hvězdičkami (*P < 0,05; * * P < 0,01).

výsledky

vliv klemizolu na chování při záchvatech u zebrafish

léčili jsme larvy mutantů scn1Lab (5 dpf) klemizolem v koncentracích mezi 30 a 400 µM a poté monitorovali účinek na chování při spontánním záchvatu pomocí softwaru pro automatické sledování lokomoce. Na základě 250 opakovaných kontrolních studií lokomoce u neléčených mutantů scn1Lab bylo jako prahová hodnota pro pozitivní potlačení záchvatového chování stanoveno snížení průměrné rychlosti plavání ≥40% (>1,5 × SD) od výchozí hodnoty. Klemizol (Obr. 1A) vykazovala antiepileptickou aktivitu při 300 a 400 µM (expozice 30 minut) a při 100 µM (expozice 90 minut) (obr. 1B); dlouhodobé expozice byly toxické při vyšších koncentracích. Abychom zjistili, zda klemizol může potlačit spontánní záchvatové chování u druhého zebrafish scn1 mutant, Prověřili jsme mutantní larvy scn1Laa (5 dpf)v testu sledování lokomoce. Larvy identifikované jako záchvatové chování ve stadiu III (např. křeče celého těla, vysokorychlostní plavecká aktivita a krátká ztráta držení těla; obr. 1C) byly potvrzeny jako vykazující elektrografické výboje s interiktálními a iktálními složkami v následných polních záznamech z předního mozku (obr. 1D). Průměrná rychlost plavání pro larvy identifikované jako S3 nebo „domnělé mutanty scn1Laa“ zebrafish byla významně vyšší než u kontrol sourozenců nebo u všech testovaných larev (obr. 1e); mutanti byli post hoc PCR potvrzeni jako scn1Laa homozygoti. Poté jsme testovali léky, u nichž bylo dříve prokázáno, že potlačují spontánní záchvaty u Dravetova syndromu a mutantů scn1Lab (250 µM stiripentol a 250 µM diazepam), jakož i 250 µM lamotrigin (AED, který může zhoršit záchvaty u Dravetova syndromu). Podle očekávání stiripentol a diazepam, ale ne lamotrigin, významně potlačily záchvatové chování u larev mutovaných scn1Laa; v tomto testu byl také účinný clemizol o velikosti 250 µM( obr. 1F). Společně tyto studie ukazují, že klemizol může potlačit záchvatové chování ve dvou různých liniích scn1 mutant zebrafish.

zkoumání mechanismu účinku klemizolu

screening sekundárního léku pomocí mutantů scn1Lab

terciární screening k identifikaci slibných sloučenin olova pro kliniku

5-exprese HT receptoru u larev zebrafish

protože clemizol má významnou vazebnou afinitu k HTR2A a HTR2B a trazodon i lorcaserin jsou signalizační modulátory 5-HT, snažili jsme se potvrdit expresi těchto receptorů u zebrafish. Zarovnání proteinové sekvence lidských a zebrafish HTR2 receptorů odhalilo evoluční konzervaci s ortology zebrafish, s Htr2aa a Htr2ab vykazujícími 59,3% proteinovou identitu s lidským HTR2A; a jediný HTR2B ortolog, Htr2b vykazující 62,0% proteinovou identitu. Kvantifikace úrovně exprese htr2 pomocí izolovaných hlav nebo ocasů 5 DPF divokých nebo scn1lab mutantních larev odhalila obohacenou expresi htr2a a htr2cl1 v hlavě. Podobné výsledky byly získány z dospělého mozku divokého typu zebrafish, protože mutantní larvy nepřežijí do dospělosti (Doplňkový obr. 4).

snížení frekvence záchvatů u pacientů s Dravetovým syndromem

Dravetův syndrom je katastrofická dětská epilepsie a vzácná porucha (http://www.rarediseases.org/) s oslabujícími výsledky včetně neřešitelné epilepsie, vážně omezeného kognitivního vývoje a rizika SUDEP. Naše předklinická data potvrzují, že modulace 5-HT signalizace může potlačit záchvaty spojené se ztrátou mutací SCN1A. Protože identifikované modulátory 5-HT jsou sloučeniny schválené FDA se známými bezpečnostními profily, léčba těmito repurposed léky by mohla změnit frekvenci záchvatů u dětí s Dravetovým syndromem. Tento translační přístup se zaměřuje na vzácná a ničivá onemocnění, u nichž nejsou proveditelné rozsáhlé klinické studie (Dunoyer, 2011; Parker et al ., 2013).

protože klemizol není v současné době vyráběn nebo dostupný ve formulaci klinického stupně a trazodon může v závislosti na koncentraci působit jako agonista nebo antagonista receptoru 5-HT (Maj et al ., 1979; Marcoli et al., 1998), rozhodli jsme se vyhodnotit Belviq® (lorcaserin) v rámci programu compassionate use off-label u malé populace dětí s Dravetovým syndromem. Ukázalo se, že tyto děti jsou rezistentní vůči nejméně pěti schváleným AED. Pět dětí (průměrný věk: 11,8 let; rozmezí: 7-18 let) heterozygotní pro deleci v SCN1A bylo prospektivně léčeno přípravkem Belviq® a podélně sledováno v dětské nemocnici Colorado (Aurora, CO). Léčebný protokol byl schválen Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB) a rodiče pacientů s Dravetovým syndromem písemně souhlasili s účastí jejich dítěte. Retrospektivně jsme přezkoumali počet atonických, myoklonických a generalizovaných tonicko-klonických záchvatů (GTC), vedlejších účinků a souběžných AED.

klinické charakteristiky Dravetova syndromu děti léčené přípravkem Belviq® jsou shrnuty v tabulce 1. Mezi pěti pacienty léčenými přípravkem Belviq®nedošlo k žádným úmrtím a přípravek Belviq® byl dobře snášen bez závažných nežádoucích účinků způsobujících ukončení léčby. Během léčby přípravkem Belviq® byl jeden pacient zpočátku bez záchvatů po dobu 3 týdnů, jeden pacient byl bez záchvatů po dobu 2 týdnů a třetí pacient měl 1-2 dny bez záchvatů týdně. U všech pěti pacientů došlo ke snížení celkového počtu záchvatů. Generalizované tonicko-klonické záchvaty byly významně sníženy u pacientů 1, 2 a 3. Pacient 2 skutečně zaznamenal 90% snížení generalizovaných tonicko-klonických záchvatů bez nutnosti záchranných léků. Dva pacienti zůstávají na přípravku Belviq® bez zvýšení frekvence záchvatů a podle očekávání byl nejčastějším zaznamenaným nežádoucím účinkem snížená chuť k jídlu. Jeden pacient znovu zahájil léčbu podruhé s dočasným zlepšením na krátkou dobu a poté se zúžil.

diskuse

Clemizol, antihistaminikum první generace objevené v 1950 s (Zierz et al ., 1952), byl identifikován jako potenciální terapeut pro léčbu Dravetova syndromu pomocí scn1Lab mutant zebrafish k screeningu repurposed knihoven léčiv (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Zde jsme potvrdili antiepileptickou aktivitu klemizolu pomocí druhého modelu scn1 zebrafish mutant. Bohužel je klemizol rychle metabolizován u myší s plazmatickým poločasem <10 min (ve srovnání s 3, 4 h u lidí) (Nishimura et al ., 2013), omezující jeho hodnocení v myších modelech. Úspěšně se používá jako antihistaminikum (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) s akutními a chronickými studiemi vykazujícími nízký stupeň toxicity (Finkelstein et al., 1960), clemizol se již nevyrábí a v současné době není k dispozici pro klinické podávání mimo označení. Chybí prostředky k efektivnímu vyhodnocení klemizolu v preklinických modelech hlodavců, použili jsme zebrafish pro cílové zapojení (5-HT receptory) a identifikaci příbuzných léčiv (trazodon a lorcaserin) s vhodnými bezpečnostními profily usnadňujícími rychlý překlad do klinické aplikace. Je také popsáno soucitné použití, předepisování přípravku Belviq® (lorcaserin) lékařsky neřešitelným pacientům s Dravetovým syndromem.

antagonisté Antihistaminikového H1-receptoru jsou obvykle kontraindikováni u pediatrických pacientů (Miyata et al ., 2011) a screening těchto léků potvrdil jejich neschopnost potlačit (a v některých případech zhoršit) záchvaty v scn1 zebrafish. Vazebná data odhalila dříve neznámou klemizolovou afinitu k receptorům HTR2A a/nebo HTR2B. Následná fenotypová obrazovka cílených knihoven identifikovala dvě 5-HT-modulační sloučeniny, trazodon a lorcaserin, schopné potlačit behaviorální a elektrofyziologické záchvaty způsobem srovnatelným s klemizolem. Belviq® (lorcaserin) je agonista HTR2C schválený FDA předepsaný pro chronickou léčbu hmotnosti (Thomsen et al ., 2008). Desyrel® (trazodon) je také antidepresivum schválené FDA, které se běžně předepisuje pro poruchy spánku (Mendelson, 2005). Často je klasifikován jako inverzní antagonista HTR2A a HTR2C a inhibitor vychytávání 5-HT (Stahl, 2009). Studie na potkanech však naznačují, že trazodon nebo jeho metabolit metachlorfenylpiperazin (mCPP) mohou působit jako agonista HTR2C při vyšších koncentracích (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). Zejména bylo dříve prokázáno, že chronická léčba trazodonem chrání před elektrokonvulzivně indukovanými záchvaty u myší (Chavan et al ., 2010; Borowicz et al., 2012), podporující naše data z scn1lab mutant zebrafish. Účinek clemizolu zprostředkovaný receptorem 5-HT je také v souladu s nedávnou fenotypovou obrazovkou, kde se ukázalo, že modulátory serotonergní signalizace (včetně klemizolu)jsou účinnou léčbou v preklinickém modelu Machado-Josephovy choroby (Teixeira-Castro et al ., 2015); a studie zde naznačují, že clemizol a trazodon vyžadují další vývoj pro testování mimo označení u pacientů s Dravetovým syndromem.

naše výsledky také přispívají k rostoucímu množství důkazů naznačujících modulaci serotonergní signalizace jako silného supresoru záchvatové aktivity, zejména u katastrofických dětských epilepsií, jako je Dravetův syndrom. Nedávno bylo 7 z 10 pacientů léčených nízkou dávkou blokátorem zpětného vychytávání 5-HT fenfluraminem hlášeno, že jsou bez záchvatů po dobu 1 roku (Ceulemans et al ., 2016). U dvou z těchto pacientů bylo hlášeno mírné zesílení jedné nebo dvou srdečních chlopní v souladu s možným vztahem mezi užíváním fenfluraminu a plicní hypertenzí (Douglas et al ., 1981; Ceulemans et al., 2016). U lidí jsou HTR2A a HTR2C exprimovány v CNS, zatímco htr2b exprese je obohacena v srdci (Lambe et al., 2011; Meltzer a kol., 2013). Přesněji řečeno, HTR2C je exprimován na subpopulaci inhibičních interneuronů (Liu et al ., 2007) a aktivace těchto receptorů pomocí 5-HT zvyšuje synaptickou inhibici zprostředkovanou GABA (Boothman et al., 2006) tj. antiepileptický mechanismus účinku, který je základem mnoha běžně předepisovaných antiepileptik. Většina preklinických studií skutečně naznačuje, že aktivace receptorů HTR2A a/nebo htr2c má antiepileptické účinky (Gharedaghi et al ., 2014; Guiard a kol., 2015), což je rozumný mechanismus účinku spojující klemizol, lorcaserin, trazodon a blokátor zpětného vychytávání 5-HT fenfluramin (Dinday et al ., 2015; Ceulemans et al., 2016). Je zajímavé, že exprese htr2b v mozku zebrafish byla relativně nízká, což dále naznačuje, že tato léčiva potenciálně vykazují antiepileptickou aktivitu prostřednictvím aktivace htr2a nebo htr2c receptoru. Je zajímavé, že studie u Drosophila knock-in mušek nesoucích lidskou mutaci K1270T SCN1A v genu para sodíkového kanálu ukázaly, že suplementace prekurzorem 5-HT (5-hydroxytryptofan)zachraňuje fenotyp záchvatů vyvolaný teplem (Schutte et al ., 2014). Navíc nedávná studie používající mutanty scn1Lab hodnotila 13 signalizačních sloučenin 5-HT a také navrhla potenciální antiepileptickou roli pro modulátory signalizace 5-HT (Sourbron et al ., 2016). Tyto poslední studie zebrafish však používaly zásadně odlišný protokol (24 h versus 30-90 min expozice léku), který nebyl dříve validován jako úspěšně identifikující AED používané při Dravetově syndromu (benzodiazepiny, valproát, stiripentol, bromidy a ketogenní strava). Navíc koncentrace léků jsou asi 10krát nižší, než prokazujeme, že jsou účinné u zebrafish (Baraban et al ., 2005, 2013; Dinday et al., 2015) a hlášení antiepileptického účinku pro halucinogen TCB-2 (obr. 5), navrhuje, aby přímé srovnání údajů z laboratoří používajících různé postupy bylo interpretováno s opatrností.

celkově jsme dospěli k závěru, že mutantní zebrafish jsou vhodným modelem pro rychlý screening a objev nových AED, které s vhodnými bezpečnostními profily mohou přímo informovat klinickou péči o ohrožené populace pacientů, jako je Dravetův syndrom.

zkratky

zkratky
• 5-HT

  serotonin

• AED

  antiepileptikum

• dpf

  dny po oplodnění

• GPCR

  receptor vázaný na G-protein

• iZAP

  integrovaná platforma pro analýzu zebrafish

poděkování

chtěli bychom poděkovat členům laboratoře Baraban, Brian Grone a Matthew Dinday zejména za užitečné diskuse v průběhu těchto studií.

financování

S. C. B uznává financování z NINDS R01 grant no. NS079214, UCSF Catalyst Award a Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatical Fund.

doplňkový materiál

doplňkový materiál je k dispozici na Brain online.