cisplatina ototoxicita zahrnuje cytokiny a signalizační síť STAT6

činidla

cisplatina a 3 – (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT) byly zakoupeny od společnosti Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, USA). Plastové kultivační materiály byly zakoupeny od společnosti Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA). Dulbecco ‚ s modified essential medium (DMEM), fetal bovinní sérum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) a další činidla tkáňové kultury byly získány od společnosti Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Rekombinantní myší IL-4 a IL-13 protein, protilátky proti IL-4, IL-13, TNF-α, IL-1β, IL-6 a enzymově vázané imunosorbentní testy (ELISA) soupravy (Kvantikiner) pro cytokiny byly zakoupeny od R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Tyto protilátky byly použity pro imunohistochemii v koncentraci 1: 200. Protilátky proti p-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) a IkB byly zakoupeny od společnosti Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

buněčná kultura a životaschopnost

vytvoření a charakterizace podmíněně zvěčněných sluchových buněk HEI-OC1 byla popsána v naší předchozí zprávě 1. Exprese OHC specifických markerů, jako je Math1 a Myosin 7a, naznačuje, že buňky HEI-OC1 představují prekurzory OHC. Buňky HEI-OC1 byly udržovány ve vysoce glukózovém DMEM (Gibco BRL) obsahujícím 10% FBS. Pro experimenty popsané níže byly buňky HEI-OC1 kultivovány za následujících permisivních podmínek: 33 °C a 5% CO2 v DMEM doplněné o 10% FBS. Buňky (3 × 104 buněk / jamka 24-jamkové destičky) byly inkubovány s 20 µM cisplatinou po dobu 24 hodin. pro stanovení životaschopnosti buněk byl MTT (0,25 mg) přidán do 1-ml buněčné suspenze po dobu 4 hodin. po promytí buněk a třech promytích PBS (pH 7,4) byl nerozpustný produkt formazanu rozpuštěn v DMSO. Optická hustota (OD) každé kultivační jamky byla poté měřena pomocí čtečky Mikrodestiček (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) při 590 nm. OD kontrolních buněk bylo odebráno pro indikaci 100% životaschopnosti. Pro zkoumání účinků různých cytokinů byly do kultur přidány neutralizační protilátky proti cytokinům po dobu 30 minut, poté byly kultivovány 20 µM cisplatinou po dobu 24 hodin.

Zvířata

STAT4−/− (backcross generation N10), STAT6−/− (backcross generation N6) a WT BALB/C myši byly zakoupeny od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Homozygotní STAT4 a stat6 ko myši byly identifikovány pomocí PCR. Myši KO nevykazovaly žádné vývojové abnormality. Pokusy byly provedeny u 6týdenních myší a všechny myši byly do 3 dnů přizpůsobeny věku. Myši byly krmeny standardní komerční dietou, zatímco byly umístěny při okolní teplotě 20-22 °C a relativní vlhkosti 50 ± 5% při cyklu světlo:tma 12:12 h ve specifickém zařízení bez patogenů. Všechny studie na zvířatech byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití na Wonkwang University School of Medicine.

Luciferase reporter assay

buňky byly přechodně transfektovány NF-kB luciferase reporter plasmid za použití transfekčního činidla, Lipofektamin 2000. Po 36 hodinách inkubace byly buňky ošetřeny cisplatinou po dobu 12 hodin v přítomnosti neutralizujících cytokinových protilátek. Buňky byly poté dvakrát promyty PBS pufrem a následně lyzovány v reportérově lyzačním pufru (Promega, Madison, WI, USA). Poté se smíchá 20 µl alikvotu lyzátu se 100 µl testovacího činidla luciferázy, poté se měřila intenzita vyzařovaného světla pomocí luminometru AutoLumat LB953 (např. A G Berthold, Bad Wildbad, Německo). Nakonec byla aktivita luciferázy měřena ve trojím vyhotovení, zprůměrována a poté normalizována proti aktivitě β-galaktosidázy pomocí systému galaktosidázy (galaktosidáza, Tropix Inc., MA, USA) podle pokynů výrobce.

transfekce s konstrukcemi siRNA

předdefinované siRNA proti myším STAT4, STAT6 a kontrolní míchané siRNA byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology. Smyslové řetězce siRNA proti STAT4 a STAT6 jsou následující. Konstrukce STAT4 siRNAs je skupina tří sekvencí siRNA takto: duplexní 1 smyslový řetězec: 5′ – IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA A-3′, duplexní 2 smyslový řetězec: 5′ – IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3′ a duplexní 3 smyslový řetězec: 5′ – IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA a-3′ (přístupové číslo mRNA: NM_011487). Konstrukce STAT6 siRNA je skupina tří sekvencí siRNA následovně: duplexní 1 smyslový řetězec: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UCU UAC AAC a-3′, duplexní 2 smyslový řetězec: 5′ – IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG a-3′ a duplexní 3 smyslový řetězec: 5′ – IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG a-3′ (přístupové číslo mRNA: NM_009284). Buňky byly přechodně transfektovány 100 nM konstrukcí siRNA v transfekčním činidle X-tremeGENE siRNA (Roche Applied Science, Penzberg, Německo) podle protokolu výrobce. Po inkubaci při 33 °C a 5% CO2 po dobu 36 h byly buňky dále ošetřeny cisplatinou po dobu 24 h. vzorky byly poté připraveny a analyzovány na životaschopnost nebo analýzu Western blot. Interference exprese byla potvrzena imunoblotovou analýzou.

měření prozánětlivých cytokinů pomocí ELISA

pro měření sekrece prozánětlivých cytokinů z buněk léčených cisplatinou byly supernatanty kultury odebrány v každém časovém bodě a hladiny sekretovaných prozánětlivých cytokinů byly poté stanoveny pomocí ELISA (Kvantikinové cytokinové soupravy; R&D Systems Inc.) podle pokynů výrobce.

Příprava cytosolických a jaderných extraktů

buňky byly promyty ledově studeným PBS, seškrábnuty a centrifugovány při 1000× g po dobu 5 minut při 4 °C.buněčná peleta byla poté resuspendována ve 200 µl lyzačního pufru (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoridu a 0,5 mM dithiothreitolu) a poté inkubována na ledu po dobu 15 minut. Na konci inkubace bylo přidáno 10 µl 10% NP-40 a zkumavka byla vířena po dobu 10 s. Po centrifugaci při 13 000× g po dobu 1 minuty při 4 °C byl supernatant (cytosolický extrakt) odebrán a skladován při -80 °C, zatímco peleta byla dále zpracována za účelem získání jaderných extraktů. Peleta byla poté resuspendována v extrakčním pufru (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM dithiothreitol a 25% (obj./obj.) glycerolu) a inkubována po dobu 30 minut při 4 °C. jaderné extrakty byly izolovány centrifugací při 13 000× g po dobu 30 minut při 4 °C. Supernatant byl poté odstraněn a skladován při -80 °C, dokud nebyl použit pro analýzu western blot. Nakonec byla koncentrace proteinu stanovena metodou Lowry.

Western blot analysis

Western blot analysis byla provedena následovně. Krátce byly buňky sklizeny a dvakrát promyty ledově studeným PBS. Celkové a nukleocytosolické frakcionované lyzáty byly poté podrobeny elektroforéze na 12% SDS-polyakrylamidových gelech po dobu 3 h při 20 mA, poté byly přeneseny do nitrocelulózy. Membrána byla poté inkubována v 5% (HM./obj.) sušeném mléčném proteinu v PBS obsahujícím 0,05% (obj./obj.) Tween-20 (PBS-T) po dobu 1 hodiny, poté byla promyta v PBS-T a poté dále reagovala s primární protilátkou (1:1 000) po dobu 1 hodiny. dále byla membrána extenzivně promyta PBS-T a poté inkubována s protilátkou anti-králičí IgG konjugovanou s HRP (1:3 000) po dobu 1 hodiny. po rozsáhlých promytích byly proteinové pásy na membráně vizualizovány pomocí chemiluminiscenční činidla podle pokynů výrobce (supersignální substrát; Pierce, Rockford, IL, USA).

in vivo experiment ototoxicity cisplatiny

všechny myši byly náhodně rozděleny do dvou skupin po šesti myších. Zvířata skupiny 1, která byla považována za kontrolní skupinu, dostala intraperitoneální injekci PBS. Zvířatům skupiny 2 byla podávána cisplatina (4 mg/kg živé hmotnosti) intraperitoneální injekcí po dobu 4 po sobě jdoucích dnů. Zvířata byla poté usmrcena v anestezii pomocí plynu CO2 den po poslední injekci cisplatiny, po které byla odstraněna temporální kost pravého ucha.

měření ABR

pro další analýzu sluchového prahu byla ABR měřena před a 24 hodin po konečném ošetření cisplatinou. Poté byly porovnány prahové změny ABR mezi před léčbou a po léčbě. Myši byly anestetizovány pomocí koktejlu ketaminu (40 mg / kg) a xylazinu (10 mg/kg) a udržovány v teple s ohřívací podložkou během záznamu ABR. Subdermální (aktivní) jehlová elektroda byla vložena do vrcholu, zatímco pozemní a referenční elektrody byly vloženy subdermálně do volné kůže pod vrcholy protilehlých uší. Testovací podněty se skládaly ze střídavých fázových tónů při frekvencích 4, 8,16 a 32 kHz. Signály byly generovány pomocí Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen software. Každý výbuch tónu (doba trvání 1 ms) byl bráněn oknem Blackmann a měl dobu vzestupu a pádu 0,5 ms bez náhorní plošiny. Podněty byly kalibrovány před každou testovací relací, zaznamenáním výstupu reproduktoru pomocí mikrofonu umístěného na úrovni hlavy zvířat. Průběhy ABR byly zprůměrovány v reakci na 300 tónů při každé testované frekvenci. Při každé frekvenci byla amplituda signálu automaticky zeslabena v krocích 10-dB od 90 dB SPL, dokud vlny ABR nezmizely ve stopách zaznamenaných s nastavením filtru 100-3 000 Hz. Posouzení Prahy bylo provedeno off-line dvěma nezávislými, experimentálně slepými pozorovateli na základě záznamů ABR.

povrchová příprava orgánu explantátů Corti

všechny myši byly usmrceny den po konečné injekci cisplatiny. Temporální kost byla disekována a fixována ve 4% paraformaldehydu po dobu 16 hodin při 4 °C a opláchnuta 0,1 M PBS. Temporální kost byla dále odvápněna 10% EDTA v PBS po dobu 3 dnů. Kochlea byla pečlivě odříznuta. Dále byly stria vaskularis a spirální VAZ odříznuty a zanechaly orgán Cortiho. Střední otočení kochlea bylo ponořeno do phalloidinu značeného TRITC (Sigma P1951, 1: 100)v PBS po dobu 20 minut. Po třech promytích PBS byl vzorek zkoumán pod fluorescenčním mikroskopem pomocí vhodných filtrů pro TRITC(excitace: 510-550 nm, emise: 590 nm).

imunohistochemické barvení a tunelový test

odstraněná temporální kost byla fixována ve 4% paraformaldehydu po dobu 16 h a poté odvápněna 10% EDTA v PBS po dobu 2 týdnů, poté byla dehydratována a vložena do parafínového vosku. Úseky 5 µm byly deparafinizovány v xylenu a rehydratovány odstupňovanými koncentracemi ethanolu. Pro imunohistochemickou studii byla použita imunohistochemická souprava (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, USA) a postupy byly provedeny podle pokynů výrobce. Endogenní peroxidáza byla poté blokována 3% peroxidem vodíku po dobu 5 minut při pokojové teplotě (RT). Po promytí sekcí v PBS byla nespecifická vazba blokována 1% bovinním sérovým albuminem po dobu 1 hodiny. primární protilátky (zředěné 1:200) byly poté přidány do sklíček, poté inkubace probíhala po dobu 1 hodiny. po opakovaném promytí PBS byly řezy inkubovány biotinylovanou sekundární protilátkou po dobu 30 minut a poté pokryty po dobu 30 minut sekundární protilátkou obsahující křenovou peroxidázu. Nakonec byly řezy obarveny v čerstvě připraveném roztoku substrátu (3 mg 3-amino-9-ethylkarbazolu v 10 ml pufru octanu sodného (pH 4,9), 500 µl dimethylformamidu, 0,03% peroxidu vodíku) po dobu 5 minut. Jádra imunobarvených buněk byla poté kontrastována Mayerovým hematoxylinem (Sigma-Aldrich Co.). Apoptotické buňky byly detekovány in situ pomocí testu TUNEL (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Německo). Krátce, sekce byla deparafinizována a rehydratována. Po inkubaci 20 µg/ml proteinázy K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Německo) byla endogenní peroxidáza blokována inkubací vzorků ve 2% H2O2 v methanolu po dobu 30 minut při RT. dále byly tkáňové řezy promyty v PBS a inkubovány s etiketovacím roztokem po dobu 1 hodiny při 37 °C. jádra byla poté protibarvena jodidem propidiumjodidem (0,5 µg/ ml, molekulární sondy) po dobu 10 minut při RT. po promytí PBS byl vzorek zkoumán pod fluorescenčním mikroskopem.

zesílení reverzní transkriptázy-PCR

pro kochleární PCR byla temporální kost levého ucha rychle sklizena a ponořena do RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) až do použití při -20 °C. poté byla celá kochlea rozřezána a použita k extrakci celkové RNA použitím Trizolu (Invitrogen) podle protokolů výrobce. Po extrakci celkové RNA pomocí Trizolu (Invitrogen) byla z celkové RNA syntetizována jednovláknová cDNA. Dále byla provedena PCR s Taq DNA polymerázou (Takara, Takara Shuzo, Japonsko) podrobením vzorků 30 cyklům 95 °C po dobu 40 s, 58 °C po dobu 40 s a 72 °C po dobu 50 s. deset mikrolitrů produktů PCR bylo poté odděleno na 1,2% agarózovém gelu a vizualizováno pod UV světlem. Sekvence primerů použitých pro amplifikaci PCR byly následující: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, reverse, 5 ‚- IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3‘).

Statistická analýza

každý experiment byl proveden nejméně třikrát a všechny uvedené hodnoty představují prostředky ± SD trojitých analýz. Statistická vícerozměrná analýza byla provedena analýzou rozptylu a duncanovými testy pomocí statistického softwaru SPSS 11 (Chicago, IL, USA). K určení významu výsledků byla použita obousměrná ANOVA a/nebo jednosměrná ANOVA. Statistické výsledky byly přezkoumány biostatistikem na úrovni masters. Hodnoty P < 0.05 byly považovány za statisticky významné.