Cirkulující nádorová DNA

Předanalytická úvahaedit

když je krev odebrána ve zkumavkách EDTA a uložena, začnou bílé krvinky lýzovat a uvolňovat genomickou DNA divokého typu do vzorku v množstvích obvykle mnohonásobně vyšších, než je přítomna ctDNA. To ztěžuje detekci mutací nebo jiných biomarkerů ctDNA. Použití komerčně dostupných zkumavek pro stabilizaci buněk může zabránit nebo oddálit lýzu bílých krvinek, čímž se sníží ředicí účinek ctDNA. Sherwood et al prokázali vynikající detekci mutací KRAS ve shodných vzorcích odebraných v tubách EDTA K3 a Streck BCT. Výhody buněčných stabilizačních zkumavek lze realizovat v situaci, kdy krev nemůže být okamžitě zpracována na plazmu.

jiné postupy mohou také snížit množství“ kontaminující “ DNA divokého typu a učinit detekci ctDNA schůdnější:

• nikdy nezmrazujte vzorek krve před extrakcí plazmy pro analýzu ctDNA
• zpracujte vzorek na plazmu během 2-4 hodin (pokud je odebrán v EDTA zkumavce)
• nikdy nepoužívejte heparinizované zkumavky, heparin inhibuje PCR napodobením spirálové struktury DNA
• proveďte dvojitý centrifugační krok (odstřeďujte krev, abyste odstranili plazmu, poté opakujte na plazmě, abyste odstranili zbytky ve spodní části zkumavky) odstranit více buněčných zbytků před extrakcí dna.
• plazma je lepší než sérum pro zotavení ctDNA

extrakce ctDNAEdit

hlavním lákadlem ctDNA analýzy je to, že je extrahována neinvazivním způsobem odběrem krve. Získání cfDNA nebo ctDNA obvykle vyžaduje odběr přibližně 3 ml krve do zkumavek potažených EDTA. Použití EDTA je důležité pro snížení koagulace krve. Plazmatické a sérové frakce krve mohou být odděleny centrifugačním krokem. z těchto frakcí lze následně extrahovat ctDNA nebo cfDNA. Ačkoli sérum má tendenci mít vyšší hladiny cfDNA, je to primárně připisováno DNA z lymfocytů. Vysoká úroveň kontaminace cfDNA je suboptimální, protože to může snížit citlivost detekce ctDNA. Proto většina studií používá plazmu pro izolaci ctDNA. Plazma se poté znovu zpracuje centrifugací, aby se odstranily zbytkové neporušené krevní buňky. Supernatant se používá pro extrakci DNA, která může být provedena za použití komerčně dostupných souprav.

analýza ctDNAEdit

analýza ctDNA po extrakci vyžaduje použití různých metod amplifikace a sekvenování. Tyto metody lze rozdělit do dvou hlavních skupin na základě toho, zda je cílem vyslýchat všechny geny v necíleném přístupu, nebo zda je cílem sledovat specifické geny a mutace v cíleném přístupu.

necílené přístupyedit

celý genom nebo celý exom sekvenační přístupy mohou být nezbytné k objevení nových mutací v nádorové DNA při sledování zátěže nemocí nebo sledování rezistence na léky. Necílené přístupy jsou také užitečné ve výzkumu k pozorování heterogenity nádorů nebo k objevování nových lékových cílů. V některých aplikacích však mohou být nezbytné necílené metody, je dražší a má nižší rozlišení. To ztěžuje detekci vzácných mutací nebo v situacích, kdy jsou přítomny nízké hladiny ctDNA (jako je minimální reziduální onemocnění). Kromě toho mohou existovat problémy rozlišující mezi DNA z nádorových buněk a DNA z normálních buněk pomocí celého genomového přístupu.

sekvenování celého genomu nebo exomu obvykle používá vysoce výkonné technologie sekvenování DNA. Omezení sekvenování pouze na celý exom může místo toho snížit náklady a zvýšit rychlost, ale za cenu ztráty informací o mutacích v nekódujících regulačních oblastech DNA. Zatímco pouhý pohled na polymorfismy DNA pomocí sekvenování nerozlišuje DNA od nádoru nebo normálních buněk, tento problém lze vyřešit porovnáním s kontrolním vzorkem normální DNA (například DNA získaná bukálním tamponem.) Důležité je, že sekvenování celého genomu a celého exomu je užitečné pro počáteční objev mutace. To poskytuje informace pro použití citlivějších cílených technik, které pak mohou být použity pro účely sledování nemocí.

sekvenování celého genomu umožňuje obnovit strukturní vlastnosti cfDNA, velikost fragmentů a jejich fragmentační vzorce. Tyto jedinečné vzory mohou být důležitým zdrojem informací pro zlepšení detekce ctDNA nebo lokalizaci tkáně původu těchto fragmentů. Výběr velikosti krátkých fragmentů (<150bp) metodami in vitro nebo In silico by mohl zlepšit obnovu mutací a aberací počtu kopií.

digitální KaryotypingEdit

tato metoda byla původně vyvinuta laboratoří Bert Vogelstein, Luis Diaz, a Victor Velculescu na Johns Hopkins University. Na rozdíl od normálního karyotypování, kde se barvivo používá k barvení chromozomálních pásů za účelem vizualizace chromozomů, digitální karyotypizace používá DNA sekvence lokusů v celém genomu za účelem výpočtu variace počtu kopií. Variace počtu kopií jsou běžné u rakoviny a popisují situace, kdy ztráta heterozygotnosti genu může vést ke snížení funkce v důsledku nižší exprese nebo duplikace genu, což vede k nadměrné expresi.

personalizovaná analýza přeuspořádaných konců (PARE)Edit

po sekvenování celého genomu pomocí vysoce výkonné sekvenační metody, jako je Illumina HiSeq, se PARE aplikuje na data pro analýzu chromozomálních přeuspořádání a translokací. Tato technika byla původně navržena pro analýzu pevné nádorové DNA, ale byla upravena pro aplikace ctDNA.

methylace DNA a Hydroxymethylaceedit

správné epigenetické značení je nezbytné pro normální genovou expresi a funkci buněk a aberantní změny v epigenetických vzorcích jsou charakteristickým znakem rakoviny. Normální epigenetický stav je udržován v buňce alespoň částečně methylací DNA. Měření aberantních methylačních vzorců v ctDNA je možné díky stabilní methylaci oblastí DNA označovaných jako „CpG ostrovy“. Methylace ctDNA může být detekována léčbou bisulfitem. Léčba bisulfitem chemicky přeměňuje nemetylované cytosiny na uracil, zatímco methylované cytosiny zůstávají nemodifikované. DNA je následně sekvenována a lze identifikovat jakékoli změny ve vzorci methylace DNA. Hydroxymethylace DNA je podobně přidružená značka, která se ukázala jako prediktivní marker zdravých versus nemocných stavů v cfDNA, včetně rakoviny. Měření aberantních hydroxymethylačních vzorců v ctDNA bylo prokázáno vědci z University of Chicago (Chuan he lab,) Stanford University (Quake lab,) a společnosti Cambridge Epigenetix.

cílené přístupyeditovat

v cíleném přístupu může být sekvenování ctDNA nasměrováno na genetický panel vytvořený na základě mutačních hotspotů pro rakovinu, která je předmětem zájmu. To je zvláště důležité pro informování o léčbě v situacích, kdy jsou mutace identifikovány v cílích léčitelných léky. Přizpůsobení cílené analýzy ctDNA každému pacientovi je také možné kombinací kapalných biopsií se standardními biopsiemi primárních tkání. Celý genom nebo celý exom sekvenování biopsie primárního nádoru umožňuje objev genetických mutací specifických pro pacientův nádor a může být použit pro následné cílené sekvenování ctDNA pacienta. Nejvyšší citlivost detekce ctDNA je dosažena cíleným sekvenováním specifických jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Běžně mutované geny, jako jsou onkogeny, které obvykle mají hotspotové mutace, jsou dobrými kandidáty pro cílené sekvenační přístupy. Naopak většina tumor supresorových genů má širokou škálu možných ztrát funkčních mutací v celém genu a jako takové nejsou vhodné pro cílené sekvenování.

cílené přístupy mají výhodu amplifikace ctDNA pomocí polymerázových řetězových reakcí (PCR) nebo digitální PCR. To je zvláště důležité při analýze ctDNA nejen proto, že v krevním řečišti cirkulují relativně nízké hladiny DNA, ale také proto, že ctDNA tvoří malou část celkové extrahované DNA bez buněk. Proto amplifikace oblastí zájmu může drasticky zlepšit citlivost detekce ctDNA. Amplifikace pomocí PCR však může zavádět chyby vzhledem k inherentní chybovosti DNA polymeráz. Chyby zavedené během sekvenování mohou také snížit citlivost detekce mutací ctDNA.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Edit

tato metoda je odvozena z digitální PCR, původně pojmenované skupinou Berta Vogelsteina na Johns Hopkins University. Droplet Digital PCR využívá generátor kapiček k rozdělení jednotlivých kusů DNA na kapičky pomocí emulze olej/voda. Pak se v každé kapičce objevují jednotlivé polymerázové řetězové reakce za použití vybraných primerů proti oblastem ctDNA a pokračují do koncového bodu. Přítomnost sledovaných sekvencí se měří fluorescenčními sondami, které se vážou na amplifikovanou oblast. ddPCR umožňuje vysoce kvantitativní hodnocení alely a mutantních frekvencí v ctDNA, ale je omezeno počtem fluorescenčních sond, které lze použít v jednom testu (až 5). Citlivost testu se může lišit v závislosti na množství analyzované DNA a je kolem 1 z 10 000.

korálky, Emulgace, amplifikace a magnetika (paprsek)Edit

tato technika staví na Kapičkové digitální PCR za účelem identifikace mutací v ctDNA pomocí průtokové cytometrie. Po extrahování ctDNA z krve se PCR provádí pomocí primerů určených k cílení na oblasti zájmu. Tyto primery také obsahují specifické sekvence DNA nebo značky. Amplifikovaná DNA se smísí s magnetickými kuličkami potaženými streptavidinem a emulguje se do kapiček. Biotinylované primery určené k vazbě na značky se používají k amplifikaci DNA. Biotinylace umožňuje amplifikované DNA vázat se na magnetické kuličky, které jsou potaženy streptavidinem. Po dokončení PCR se korálky vázané na DNA oddělí pomocí magnetu. DNA na kuličkách se pak denaturuje a nechá se hybridizovat s fluorescenčními oligonukleotidy specifickými pro každou šablonu DNA. Výsledné komplexy korálek-DNA jsou pak analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Tato technika je schopna zachytit alely a mutační frekvence díky spojení s ddPCR. Na rozdíl od ddPCR však může být vyslýchán větší počet sekvencí DNA kvůli flexibilitě použití fluorescenčně vázaných sond. Další výhodou tohoto systému je, že izolovaná DNA může být také použita pro následné sekvenování. Citlivost je 1,6 v 104 až 4,3 v 105.

personalizované profilování rakoviny pomocí hlubokého sekvenování (CAPP-Seq)Edit

tato metoda byla původně popsána skupinami Ash Alizadeh a Maximilian Diehn na Stanfordské univerzitě. Tato technika používá biotinylované oligonukleotidové selektorové sondy k cílení sekvencí DNA relevantních pro detekci ctDNA. Veřejně dostupné databáze rakoviny byly použity k vytvoření knihovny sond proti opakujícím se mutacím v rakovině výpočtem jejich indexu recidivy. Protokol byl optimalizován pro nízké hladiny DNA pozorované při sběru ctDNA. Pak izolovaná DNA prochází hlubokým sekvenováním pro zvýšenou citlivost. Tato technika umožňuje výslech stovek oblastí DNA. Citlivost detekce ctDNA CAPP-Seq je hlášena jako 2,5 molekul v 1 000 000.

Tagged AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq)Edit

TAM-Seq umožňuje cílené sekvenování celých genů pro detekci mutací v ctDNA. Nejprve se provede obecný amplifikační krok pomocí primerů, které pokrývají celý Gen zájmu v řezech 150-200bp. Poté se mikrofluidický systém používá k připojení adaptérů s jedinečným identifikátorem ke každému amplikonu pro další amplifikaci DNA v paralelních singleplexových reakcích. Ukázalo se, že tato technika úspěšně identifikuje mutace rozptýlené v TP53 tumor supresorovém genu u pokročilých pacientů s rakovinou vaječníků. Citlivost této techniky je 1 z 50.

Safe-seq (Safe-Seq)Edit

tato metoda byla původně popsána Bert Vogelstein a jeho skupina na Johns Hopkins University. Safe-Seq snižuje chybovost masivně paralelního sekvenování, aby se zvýšila citlivost na vzácné mutanty. Toho dosahuje přidáním sekvence jedinečného identifikátoru (UID) ke každé šabloně DNA. DNA se pak amplifikuje pomocí přidaných UIDs a sekvenuje. Všechny molekuly DNA se stejným UID (rodina UID) by měly mít stejnou hlášenou sekvenci DNA, protože byly amplifikovány z jedné molekuly. Mutace však mohou být zavedeny amplifikací nebo mohou být v krocích sekvenování a analýzy vyvolány nesprávné přiřazení báze. Přítomnost UID umožňuje oddělit tyto chyby metodiky od skutečných mutací ctDNA. Mutace je považována za „supermutant“ , pokud 95% sekvenovaných čtení souhlasí. Citlivost tohoto přístupu je 9 z 1 milionu.

duplexní sekvenceeditovat

tato metoda je vylepšením jednotlivých UID přidaných v technice Safe-Seq. V duplexním sekvenování působí randomizovaná dvouvláknová DNA jako jedinečné značky a jsou připojeny k invariantní distanční vložce. Značky jsou připojeny na oba konce fragmentu DNA (α a β tagy), což má za následek dvě jedinečné šablony pro PCR-jeden řetězec s α tagem na 5 ‚konci a β tag na 3‘ konci a druhý řetězec s β tagem na 5 ‚konci a α tag na 3‘ konci. Tyto fragmenty DNA jsou pak amplifikovány primery proti invariantním sekvencím značek. Amplifikovaná DNA je sekvenována a analyzována. DNA s duplexními adaptéry jsou porovnávány a mutace jsou přijímány pouze tehdy, pokud existuje shoda mezi oběma řetězci. Tato metoda bere v úvahu jak chyby ze sekvenování, tak chyby z amplifikace PCR v rané fázi. Citlivost přístupu k objevování mutantů je 1 v 10^7.

integrované potlačení digitálních chyb (iDES) – enhanced CAPP-SeqEdit

iDES zlepšuje CAPP-Seq analýzu ctDNA s cílem snížit chybu a tím zvýšit citlivost detekce. Hlášeno v roce 2016, iDES kombinuje CAPP-Seq s technologií duplexního čárových kódů a výpočetním algoritmem, který odstraňuje stereotypní chyby spojené s krokem hybridizace CAPP-Seq. Metoda také integruje duplexní sekvenování, pokud je to možné, a zahrnuje metody pro efektivnější duplexní obnovu z DNA bez buněk. Citlivost této vylepšené verze CAPP-Seq je 4 ve 100 000 kopiích.