Státní veterinární diagnostická laboratoř, Texas A&m veterinární lékařská diagnostická laboratoř, TVMDL, testuje stovky tisíc vzorků ročně. Nicméně, na pokraji roční sezóny lovu jelenů, čísla testů začínají stoupat, protože poptávka po chronickém plýtvání, CWD, testování se zvyšuje.
co je chronické plýtvání?
CWD je progresivní neurologické onemocnění, které postihuje několik druhů cervidů. CWD náchylné druhy jsou jelen běloocasý, jelen černoocasý, jelen mezek, los, jelen, sob, sika a los. Od doby, kdy byl poprvé zaznamenán v roce 1967, byl zdokumentován jak v zajetí, tak ve volném výběhu druhů jelenovitých ve 25 státech a třech kanadských provinciích.
CWD získala v posledních letech určitou pozornost, když se objevily zprávy o „nemoci zombie jelenů“ a rozšířily se v různých médiích. Ačkoli chytlavý, „zombie deer disease“ je ve skutečnosti nesprávné pojmenování, protože zvířata postižená CWD nejsou mrtvá. Jakmile je postiženo, může trvat dva až čtyři roky, než infikované zvíře začne vykazovat klinické příznaky, které mohou v průběhu onemocnění napodobovat „zombie“ chování. Postižená zvířata vykazují známky, jako je ztráta hmotnosti, slintání, klopýtání a stupor. Tato kombinace klinických příznaků vrcholí u zvířete, které se zdá „plýtvat“, “ ražení skutečného názvu nemoci.
podobně jako bovinní spongiformní encefalopatie, BSE, u skotu a klusavka u ovcí a koz je CWD přirozeně se vyskytující přenosná spongiformní encefalopatie, TSE nebo prionové onemocnění. Priony jsou abnormální proteiny a je velmi obtížné je zničit. Jakmile jsou priony infikovány, zpočátku ovlivňují lymfatické uzliny zvířete a po šíření tělem nakonec infikují mozek.
v roce 2012 byl CWD poprvé objeven v Texasu u volně se pohybujících jelenů v horách Hueco. Od té doby, nemoc byla nadále detekována v oblastech západního Texasu a Panhandle u jelenů, jelenů bílých a losů.
ačkoli Texaská historie CWD byla ve srovnání s jinými státy krátká, diagnostické testování se stále zvyšuje, když se státní agentury pokoušejí kontrolovat nemoc. V Texasu je TVMDL jedinou laboratoří schválenou pro testování CWD.
zadavatelé CWD: kdo jsou?
v loňském roce provedla TVMDL přibližně 26 500 testů CWD. Z celkového počtu testů byla od října do prosince provedena téměř polovina. Tento nárůst podání CWD se shoduje s loveckou sezónou jelenů v Texasu.
lovci musí dodržovat určité pokyny během sezóny jelenů kvůli Texas Parks and Wildlife Department, tpwd, programům zaměřeným na zmírnění šíření CWD. Například, pokud je jelen zabit v zóně v karanténě CWD, vzorky musí být odebrány a předloženy k testování CWD. Odběr vzorků se provádí na kontrolních stanicích lovců, v zařízeních na zpracování jelenů a někdy i v preparátorech.
žádosti o zkoušky CWD předkládají státní agentury, jako jsou TPWD a Texas Animal Health Commission, TAHC a chovatelé jelenů. TVMDL poskytuje služby těmto agenturám a odvětví jelenů, aby pomohla s pokračujícím úsilím o sledování šíření nemocí, jako je CWD.
detekce onemocnění
jednou v laboratoři testuje TVMDL vzorky jednou ze dvou metod: enzymově vázaný imunosorbentový test, ELISA nebo imunohistochemie, IHC. Obě zkušební metody vyžadují tkáně získané z jelenových lymfatických uzlin nebo z obexu.
testování ELISA
nejžádanější metodou je test ELISA. Tato metoda je citlivější možností, protože používá čerstvé tkáně na rozdíl od tkání fixovaných v konzervačním činidle. Celý proces, s výjimkou doby přípravy vzorku, obvykle trvá asi tři hodiny. Jakmile vzorek dorazí do sekce sérologie na TVMDL, začne první ze tří fází: příprava vzorku.
během přípravy vzorku jsou přesné objemy a anatomické umístění lymfatických uzlin a/nebo obexových tkání řezány a umístěny do jedinečných mlecích zkumavek. Trubky jsou umístěny na homogenizačním přístroji, který zkapalňuje tkáně a připravuje je pro druhou fázi testování, čištění.
fáze čištění je poloautomatická. Přístroj pro manipulaci s kapalinou začíná zpracováním vzorku. Tento proces tráví normální priony pomocí proteinázy K a zanechává priony způsobující onemocnění, pokud existují. Poté se kapalný konečný produkt procesu čištění odstředí za vzniku pelety. Peleta se zpracuje podruhé a poté se zředí. Peleta se poté přesune do závěrečné fáze testování a určí, zda jsou přítomny priony CWD.
detekce je poslední fází procesu testování ELISA. V této fázi se zředěný vzorek pelet zkouší pomocí sendvičové ELISA. Sendvičová ELISA používá dvě vrstvy protilátek ke stanovení koncentrace konkrétního antigenu,v tomto případě prionu CWD. Během procesu se přidá substrát měnící barvu jako vizuální indikátor přítomnosti prionů CWD ve vzorku. Pokud vzorek vyvine významnou změnu barvy, považuje se za „počáteční reaktor“, IR, a je znovu testován. IR vzorky, které po opakovaném testování stále naznačují přítomnost prionů CWD, jsou předány ministerstvu zemědělství USA-Veterinární a rostlinolékařská inspekční služba, USDA-APHIS, National Veterinary Services Laboratory.
testování IHC
druhá možnost testování CWD TVMDL, IHC, používá pevné nebo konzervované tkáně. Pokud tkáně dorazí na TVMDL čerstvé nebo nejsou dobře fixovány, do procesu se přidá den, aby se poskytl čas na fixaci tkání ve formalinu, dokud nejsou připraveny k testování.
jakmile jsou tkáně dobře fixovány, jsou umístěny do jednotlivě označených plastových kazet. Kazety jsou nezbytné pro následující krok, ve kterém jsou tkáně zpracovávány po dobu asi 13 hodin. Během této doby jsou tkáně dehydratovány a veškerá voda je nahrazena parafínovým voskem, aby se zachovala buněčná struktura tkáně.
po zpracování jsou tkáně vloženy do formy parafinového vosku, aby se připravily pro krájení pomocí mikrotomu. Tento nástroj rozřezává voskový tkáňový blok na 5 mikronů silné části, tenčí než pramen lidských vlasů.
tenká část tkáně je upevněna na skleněném sklíčku. Po vysušení přes noc jsou skleněné sklíčka připraveny k barvení. Sklíčka jsou ošetřena, aby se odstranil parafin a zajistilo se, že během procesu barvení jsou k dispozici vazebná místa antigenu. Tento proces identifikuje CWD antigeny v tkáni vazbou anti – prionové molekuly na CWD antigen v pozitivní tkáni a poté vazbou červeného chromogenu na tuto molekulu.
tento poloautomatický proces barvení trvá celkem přibližně šest hodin; dvě hodiny manuální práce a čtyři automatizované hodiny. Během tohoto časového rámce mohou tři barvicí nástroje obarvit skleněné sklíčka 90. Po dokončení barvení jsou všechny snímky zakryty a podány patologům TVMDL, kteří mikroskopicky kontrolují každý snímek na přítomnost CWD.
podobně jako zkušební metoda ELISA, je-li u vzorku podezření, že má CWD, odeslán do laboratoře národní veterinární služby v Ames v Iowě k potvrzujícímu testování a konečné diagnóze.
rozdíl TVMDL
ačkoli jiné laboratoře v USA nabízejí testování CWD, TVMDL se odlišuje díky své oddanosti jednotlivcům v Texas deer průmyslu. Agentura úzce spolupracuje s dalšími státními agenturami a chovateli jelenů na navázání pracovních vztahů a osobních vazeb.
pro více informací o testování CWD na TVMDL navštivte tvmdl.tamu.edu nebo volejte laboratoř College Station na 1-888-646-5623.