chp1 chromatomain váže ocas h3k9me a jádro nukleosomu za účelem sestavení heterochromatinu

plazmidy a konstrukce kmenů

Chp1CD mutanty pro expresi a purifikaci byly generovány pomocí inverzní PCR pomocí primerů uvedených v doplňkové tabulce S2 počínaje chromatomainem pET28a Chp1 plasmid. Testy záchrany heterochromatinu byly provedeny zavedením plazmidů obsahujících chp1 wt A chp1 mutantní protein pod jeho endogenní promotor v kmeni chp1Δ (SP170, viz doplňková tabulka S3). chp1 celovečerní gen a jeho endogenní promotor (-949 bp od začátku chp1 + kódující sekvence) byly klonovány v plazmidu pREP1. chp1 chromodomain mutanty byly generovány inverzní PCR pomocí primerů uvedených v doplňkové tabulce S2 a transformovány v indikovaném kmeni chp1Δ.

pro genomickou integraci byl plazmid pREP1 upraven tak, aby nahradil promotor nmt1+ následující integrační kazetou: (SphI) oblast na 5′ genu Chp1 (chromozom I, 2215500-2215055) (AscI)—kazeta rezistence HphMX6 -(SphI) endogenní promotor Chp1 (chromozom I, 2214829-2214664)—kódovací sekvence Chp1—(BamHI) Terminátor Chp1 (chromozom I, 2210976-2210582) (bamhi). Integrační kazeta (jak kazeta chp1+, tak kazeta chp1LOOP1B/2B) byla poté PCR amplifikována a transformována elektroporací na kmeny SP101, SP170 a SP64. Buňky byly poté vybrány na deskách Yes+ Hygromycin (50 mg ml−1 Hygromycin). Jednotlivé kolonie byly izolovány, PCR screenovány a sekvenovány pro genomické vložení rezistenční kazety HphMX6 a mutací LOOP1B/2B.

kmeny obsahující plazmidy byly pěstovány na médiu Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC) – leu. Všechny kmeny a plazmidy použité v této studii jsou uvedeny v doplňkových tabulkách S3 a S4.

purifikace proteinů

His6-SUMO-Chp1CD a všechny CD mutanty byly exprimovány v e. coli BL21 (DE3) (pLys) a čištěná afinitní chromatografií pomocí ni-NTA pryskyřice (GE Healthcare, Freiburg, Německo). His6-SUMO-Chp1CD obsahuje místo štěpení trombinu mezi dvěma značkami .

celkem bylo přidáno 0,2 mM IPTG k indukci exprese proteinu s následným růstem při 18 °C O/N. buňky byly odebrány centrifugací a znovu suspendovány v lyzačním pufru (20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonové kyseliny (HEPES) pH 7,5, 150 mm NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 20 mM imidazol). Po zmrazení zábleskem byly buňky rozmrazeny a inkubovány po dobu 30 minut v lysozymu před sonikací (Branson Sonifier 250-výstup 4, pracovní cyklus 40). Suspenze se odstředí (12000 g, 20 min při 4 °C) a supernatant se přidá k pryskyřici Ni-NTA předem vyrovnané ve vazebném pufru (20 mM HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidazol) a inkubuje se 30 minut při 4 °C při rotaci. Pryskyřice byla poté 5× promyta vazebným pufrem a proteiny byly eluovány v elučním pufru (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidazol). Chp1CD wt a mutanty byly poté dyalizovány O / N v pufru obsahujícím 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD se pak dále čistí gelovou filtrací (Superdex 75 pg; GE Healthcare) a dialyzuje se v pufru obsahujícím 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCL, 0,5 mM DTT.

Silencing assays

buňky pro silencing assays byly pěstovány na od 0,7-1 a poté normalizovány na konečnou koncentraci 1×107 buněk ml−1 kultury. Desetinásobná sériová ředění byla provedena tak, aby místo s nejvyšší hustotou obsahovalo 1×105 buněk. Buňky byly pozorovány na neselektivních (Ano) a 5-fluoro-orotických deskách (5-FOA 1 g l−1 5-FOA). Destičky byly inkubovány při 32 °C po dobu 2-3 dnů a zobrazovány. Buňky mají reportážní Gen ura4 vložený do pericentromerních IMR repetic (heterochromatický lokus). Když je reportér genu ura4 umlčen, buňky mohou růst na médiu obsahujícím 5-FOA. Při ztrátě heterochromatinu je exprimován reportér genu ura4 a buňky nejsou schopny růst na médiu 5-FOA.

detekce hladin RNA pomocí qPCR (RT-qPCR)

kvasinkové kultury (10 ml) byly pěstovány na OD600 0,7–1,5. Buňky byly poté znovu suspendovány v 500 µl lýzním pufru (300 mM naoac pH 5,2, 1% dodecylsulfátu sodného) a 500 µl fenol-chloroformu a inkubovány při 65 °C po dobu 10 minut za stálého míchání. Vodná frakce se oddělí od fenol–chloroformu centrifugací (10 min, 20 000 g) a vysráží se ethanol. Nukleové kyseliny byly ošetřeny Dnázou I (Roche, Basilej, Švýcarsko) po dobu 30 minut při 37 °C, následovanou 15 minut při 75 °C tepelnou inaktivací. Komplementární DNA byla syntetizována za použití 100 ng RNA a 1 pmol DNA oligos s horním indexem III (Invitrogen, Darmstadt, Německo) za standardních podmínek. Hladiny RNA byly kvantifikovány pomocí qPCR pomocí sady biozym DyNAmo Flash qRT-PCR a normalizovány na euchromatický Gen tdh1.

RNA elektroforetické testy mobility shift

RNA shift assay byly provedeny podle dříve hlášených podmínek . Celkem, 0.66 pmolů 32P radioaktivně značené 30 nt centromerní RNA bylo inkubováno s 10 µM Chp1 chromodomainem (divoký typ a mutant) v pufru obsahujícím 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCL, 0,5 mM DTT a 3% glycerolu. Pro RNA EMSA s centromerickými transkripty 100 nt dg byly inkubovány 2 pmoly radioaktivně značené RNA 32P 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmoly proteinu Chp1CD (mutant wt A LOOP1B/2B) v konečném objemu 15 µl. Peptid H3K9me3 (Eurogentec, Köln, Německo )byl přidán při peptidu Chp1CD-H3K9me 1: 1, Jak je uvedeno v. Inkubace byla prováděna po dobu 1 hodiny na ledu a vzorky (20 µl konečného objemu) byly poté naplněny 10% nativním gelem akrylamidu-TBE (poměr Bis-akrylamidu 1:29). Pro in vitro RNA pull-downs byl 1 µg SUMO-Chp1CD (mutant divokého typu a LOOP1B/2B) vázán na 15 µl ni-NTA pryskyřice (GE Healthcare) a h3k9me3nukleosom byl přidán k sestavení komplexu Chp1CD-H3k9me3nukleosom ve vazebném pufru (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl,0,5 mM DTT, 20 mM imidazol). Po trojnásobném promytí 50 µl vazebného pufru byly přidány 2 pmoly 100NT DG RNA značené 32P a inkubovány s Chp1CD-nukleosomovou pryskyřicí na ledu po dobu 1 h. pryskyřice byla odstředěna pomalou rychlostí (60 g, 10 s) a shromážděna průtoková. Pryskyřice byla třikrát promyta alespoň 3× (v/v) vazebným pufrem a komplex Chp1CD-nukleosom-RNA byl eluován přidáním 300 mM imidazolového pufru (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM imidazol), inkubován po dobu 1 hodiny na ledu s 5 min intervalovým mícháním (vázaná frakce). Vzorky byly naloženy na 10% TBE nativním Akrylamidovém gelu (bis-Akrylamidový poměr 1:29) a po dobu 2 h při 10 mA při 4 °C. po noční expozici byly gely skenovány pomocí Fosfoimageru TyphoonFLA9000.

chromatinová imunoprecipitace

kvasinkové kultury (100 ml) byly pěstovány na 0,7 OD600 a zesíťovány 3% formaldehydem při pokojové teplotě po dobu 15 minut, jak je popsáno . Reakce byla ochlazena 125 mM glycinem po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Buňky byly znovu suspendovány v 500 µl lýzním pufru (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 M octan sodný, 5 mM MgCl2, 2 mM kyselina ethylendiamintetraoctová, 2 mM kyselina ethylenglykol tetraoctová, 0,1% NP-40, 20% glycerol) obsahující inhibitory proteázy (koktejlové tablety inhibitoru proteázy, Roche, kompletní, kyselina ethylendiamintetraoctová). Zmrazené buňky byly lyzovány pomocí Bead beater MP Biospec. Po lýze byl extrakt sonikován 35× po dobu 30 s (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgie) a točil se při 13 000 g po dobu 15 minut, aby se získal supernatant chromatinu. Pro vstupní DNA bylo použito 50 µl supernatantu. U imunoprecipitací byly supernatanty normalizovány na základě koncentrace proteinu a inkubovány s anti-dimethylovanou protilátkou H3K9 nebo protilátkou proti Chp1 (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 a Chp1, číslo Abcam Ab18191), imobilizované na magnetických Dynabeádách, po dobu 2 h při 4 °C. kuličky a imobilizovaný protein byly promyty 5× 1 ml lyzačního pufru. Proteiny byly eluovány inkubací se 150 µl elučního pufru (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM kyselina ethylendiamintetraoctová, 1% dodecylsulfát sodný) při 65 °C po dobu 15 minut. Křížové vazby byly obráceny inkubací při teplotě 65 °C přes noc následovanou degradací RNA s Rnázou A a degradací proteinů s Proteinázou k. DNA byla poté získána extrakcí fenol–chloroformu a srážením ethanolem a kvantifikována pomocí qPCR. Pro normalizaci byl použit euchromatický Gen tdh1. Oligonukleotidy používané v imunoprecipitačních testech chromatinu jsou uvedeny v doplňkové tabulce S2.

rekonstituce nukleosomu in vitro a (H3K9me3) methylace

nukleosomy byly rekonstituovány za použití histonů Xenopus laevis a sekvence 601, jak bylo dříve popsáno . In vitro methylace byla provedena tak, jak je popsáno . Vrchol při + 42 Da byl pozorován v původní publikaci a nejedná se o kontaminaci (Matt Simon, personal communication and described in).

in vitro Chp1CD–H3K9me3 tvorba a eluce MLA nukleosomového komplexu

celkem bylo 5 µg Chp1CD vázáno na 15 µl ni-NTA pryskyřice ve vazebném pufru (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol) po dobu 20 minut při 4 °C. Pryskyřice byla jednou promyta pěti objemy vazebného pufru a 10 µg analogu h3k9me3 methyl lysinu (MLA) byly přidány nukleosomy (nukleosomy MLA byly dříve dialyzovány ve vazebném pufru) v konečném objemu 20 µl a inkubovány 1 h na ledu s konstantní re-suspenzí každých 5 minut. Po inkubaci byla pryskyřice centrifugována (60 g po dobu 10 s) a průtok se shromáždil. Pryskyřice byla poté třikrát promyta pěti objemy vazebného pufru. Komplex SUMO-Chp1CD-H3k9me3nukleosomu byl eluován přidáním trombinu (Sigma, Mnichov, Německo) po dobu 2 hodin na ledu ve 20 µl vazebného pufru. Tvorba komplexu byla poté hodnocena elektroforézou SDS-polyakrylamidového gelu na 15% akrylamidových gelech a negativním barvením EM.

Chp1CD h3k9me3 peptidové vazebné testy

celkem byl 1 µg-Histonového H3 (1-21)-GGK(Biotin) peptidu (Eurogentec) inkubován s 15 µl streptavidinové agarózové pryskyřice (Invitrogen) v 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. Poté bylo přidáno přibližně 5 µg Chp1CD (wt i mutanty) v konečném objemu 20 µl a inkubováno po dobu 1 hodiny na ledu za stejných podmínek pufru. Pryskyřice byla třikrát promyta a poté byla účinnost vazby hodnocena na elektroforéze SDS-polyakrylamidového gelu na 15% akrylamidových gelech. Kvantifikace vazby byla provedena pomocí softwaru ImageJ. Vazba každého mutanta byla normalizována na WT Chp1CD pro každý test.

Mikroměřítková termoforéza (MST)

pro MST byla značka SUMO odstraněna z konstrukcí Chp1CD proteázou Ulp1. Celkem bylo 100 µg divokého typu a mutantního Chp1CD fluorescenčně značeno pomocí mo-L003 Monolith protein labelling Kit BLUE-NHS (Amine Reactive) podle pokynů výrobce (Nanotemper Technologies, Mnichov, Německo). Poměr Fluorescence:Protein 1: 1 byl odhadnut pomocí funkce softwaru Nanodrop1000 „proteiny a štítky“ a každý Chp1 Chromodomain byl spuštěn na 15% SDS akrylamidovém gelu, aby se normalizovaly koncentrace na 0,1 mg ml−1.

reakce byly shromážděny ve 20 µl s 300 ng fluorescenčního Chp1CD a zvyšující se množství-Histon H3 (1-21)-GGK(Biotin) peptidu (Eurogentec) nebo H3k9me3nukleosomů, v pufru obsahujícím 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT a 0,05% Tween-20. Pro h3k9me3nukleosomy vázající testy glycerol byl přidán do 10% konečné koncentrace. Pro testy H3K9me3 byla tato ředění použita pro měření: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Pro H3k9me3nukleosomový test jsme použili následující ředění pro měření: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 µM, 1,2 µM, 1,4 µM, 1,6 µM, 2,4 µM.

MST běhy byly provedeny za použití standardních ošetřených kapilár (Nanotemper Cat#K002) na NT.115 Monolit. Všechna měření byla provedena pomocí 80% LED a 40% MST výkonu, s 30 s laserem v čase a 5 s laserem v době vypnutí. Pro každý experiment bylo provedeno pět samostatných měření.

Data byla analyzována pomocí softwaru GraphPad Prism verze 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) a SigmaPlot Software verze 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). Pro peptidové vazebné testy, s křivkami ukazujícími zřetelný sigmoidní trend, jsme namontovali logistickou asymetrickou sigmoidální rovnici Richards five Parameter a automaticky vypočítali Kd. Pro testy vázající H3k9me3nukleosom, protože trend surových dat již nebyl sigmoidní pro všechny analyzované proteiny, byla použita polynomiální (kubická) rovnice třetího řádu pro montáž a porovnání surových datových bodů divokého typu Chp1CD a různých mutantů. Kd byl vypočítán na základě funkce „interpolace“ softwaru GraphPad prism s použitím 50% vázané / nevázané hodnoty na ose y.

trávení Nukleosomových trypsinů

bezocasé nukleosomy byly připraveny inkubací rekonstituovaných nukleosomů imobilizovanou pryskyřicí TPCK-Trypsin (Termoscientific) po dobu 2 h při pokojové teplotě v pufru obsahujícím 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCL, 0,5 mM DTT . Tryptické trávení vytváří velmi definované histonové pásy a bylo podrobně charakterizováno, kde přesně trypsin řezá .

testy vázající nukleosom s mutanty Chp1CD

Chp1CD divoký typ a mutantní nukleosom vázající testy byly provedeny, jak bylo popsáno výše pro tvorbu komplexu Chp1CD—H3KC9me3 MLA nukleosomů v 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCL, 0,5 mM DTT, 40 mM imidazol. Pryskyřice a vstupy byly provozovány na SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze 15% akrylamidových gelů. Všechny vzorky byly poté analyzovány imunoblotem s anti-H3 histonem (AbCam, Cambridge, UK, 1: 1000) nebo anti-H3k9me3 protilátkou (AbCam, 1:1000), anti-kozí IgG-HRP (BioRad, 1: 3000) anti-králičí IgG-HRP (BioRad, Mnichov, Německo, 1:3000).

elektronová mikroskopie s negativními skvrnami

po eluci trombinu byly 3 µl Nukleosomového komplexu Chp1CD–H3KC9me3 spatřeny na měděné mřížce vypouštěné záři (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Německo) potažené uhlíkovým filmem 1 nm po dobu 45 s. po rychlém promytí vodou byla mřížka inkubována po dobu 15 s ve 2% Uranylacetátu. Negativní skvrny byly shromážděny na transmisním elektronovém mikroskopu FEI Morgagni.

Kryo-EM na komplexu Nukleosomů Chp1CD-H3KC9me3

kryo-EM mřížky (děrované uhlíkové mřížky, Cu 300 Mesh R3 / 3+1 nm uhlíková vrstva, Kvantifikační vrstva) byly připraveny za použití Vitrobot Mark IV (FEI Company). Data Cryo-EM byla shromážděna pomocí přenosového elektronového mikroskopu Titan-Krios (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) při 200 KeV a zvětšení 113 000× v rovině CCD pomocí kamery F816 CMOS (TVIPS GmbH, Gauting, Německo), což vedlo k velikosti obrazových pixelů 1,2 Å na pixel na objektové stupnici (velikost pixelů CCD byla 13,6 µm). Pro automatizovaný sběr dat byl použit software EM-TOOLS a data byla shromažďována v rozsahu rozostření 10 000-40 000 Å.

celkem bylo vybráno 2 480 mikrografů pro komplex Chp1CD–H3KC9me3 a 991 mikrografů pro kontrolu nukleosomů H3KC9me3 pro analýzu jednotlivých částic pomocí softwarového balíčku Xmipp (Doplňkový obrázek S9A). Několik tisíc částic bylo ručně vybráno a pečlivě vyčištěno od hluku. Tyto částice byly poté použity pro poloautomatický a automatický sběr částic v XMIPP. Funkce přenosu kontrastu byla určena CTFFIND3 . Vybrané jednotlivé částice byly převedeny na formáty SPIDER a RELION pro další analýzu (Doplňkový obrázek S9B). Dvourozměrné průměry tříd byly generovány pomocí softwarového balíčku RELION (Doplňkový obrázek S9C). Špatné průměry třídy byly odstraněny z další analýzy dat. Trojrozměrná vylepšení byla následně provedena pomocí softwarových balíčků SPIDER a RELION .

klasifikace částic bez dozoru byla provedena náhodným setím s úplnými mapami hustoty bez cílené klasifikace v softwarovém balíčku SPIDER. Pokusy o použití cílené klasifikace vyústily v silné zkreslení a nadměrné přizpůsobení šumu v zájmových oblastech. Proto jsme nepoužili cílenou klasifikaci ke snížení zaujatosti. V počáteční klasifikaci provedené ve Spideru byly třídy C0–C6 a N0–N5 zpětně projektovány pomocí úhlů z map C0 a N0 a tyto třídy nebyly zcela vylepšeny. Zde jsme chtěli vybrat třídy, které měly další hustotu vázanou na nukleosom. Částice vytvářející mapy s různými hustotami Chp1CD byly odděleny a dále klasifikovány. Přibližně 20 kol náhodných klasifikací setí bylo provedeno, dokud jsme rozdělili částice do pěti různých skupin (Doplňkový obrázek S3). Třídy C11-C15 byly vylepšeny softwarovým balíčkem RELION. Finální vylepšení komplexů Chp1CD-H3k9me3nukleosomů (třída C15) a kontrola Nukleosomů byla provedena pomocí softwarového balíčku RELION. Pro konečné upřesnění byl odkaz filtrován na ~50 Å (RELION filtr). Odkaz, který jsme použili, neměl žádný z rysů pozorovaných při rafinovaných rekonstrukcích (dvojitá šroubovice DNA není vyřešena ,hlavní drážka není viditelná, α-šroubovice nejsou vyřešeny). To nenaznačuje žádné referenční zkreslení v naší struktuře. Rozlišení kontroly Nukleosomů dosáhlo 7,3 Å pomocí automatického upřesnění v symetrii RELION a C2 (FSC 0,143 cutoff dvou nezávisle rafinovaných map). Chp1CD-h3k9me3nukleosomový komplex byl rafinován na 10 Å (FSC 0.143 cutoff dvou nezávisle rafinovaných map) bez použití symetrie.

Lokální rozlišení bylo vypočteno pomocí softwaru ResMap (konečný jediný svazek, minRes=7, maxRes=14, automask). Střední rozlišení stanovené Resmap je 9,4 Å pro Chp1CD-H3k9me3nukleosomový komplex, nezávisle potvrzující dříve stanovené průměrné rozlišení 10 Å (FSC 0,143) (obrázek 1c). Pro Chp1CD-H3k9me3nukleosomový komplex je lokální rozlišení pro nukleosom 9-10 Å a pro ligand ~10 Å (obrázek 2a). Eulerova distribuce úhlu pro konečné rekonstrukce je znázorněna jak pro nukleosom, tak pro Chp1CD-h3k9me3nukleosomový komplex (Doplňkový obrázek S9D). Všechny orientace jsou přítomny s preferencí pro horní a boční pohledy.

molekulární modely byly postaveny pomocí softwarového balíčku Chimera s použitím tuhého tělesa krystalových struktur . Přizpůsobení hustoty bylo provedeno s možnostmi chiméry „zapadnout do mapy“ a „zapadnout do segmentů“ pouze s drobnými manuálními úpravami. Segmentace a vizualizace všech cryo-EM map byla provedena také pomocí softwaru Chimera .