Chiméry

co poskytnete Část I

• číslo účtu.
• buněčná linie ES bez mykoplazmy se 40 chromozomy.

co budeme dělat

• vstříkneme přibližně 50 blastocyst na buněčnou linii ES. To by mělo mít za následek narození 10 myší. Očekává se, že tři z myší budou silné samčí chiméry. Máme prokazatelné úspěchy.
• myši budeme umisťovat až do odstavení (tři týdny po narození).

co poskytnete Část II

• odstavené myši budete ubytovat.

náklady

• $ 3,300 za 129 buněčnou linii a náklady na dárcovské ženy; $ 4,950 za buněčnou linii a náklady na dárcovské ženy pro jiné genetické pozadí.
• místní, non-CWRU objednávky budou účtovány další $ 200 pro balení a přepravu myší. Non-místní objednávky budou účtovány $ 200 a náklady na dopravu.

dodržování předpisů

• vyšetřovatelé potřebují protokol IACUC od své instituce, aby mohli přijímat myši z jádra. Protokoly CWRU IACUC musí specifikovat použití Case transgenního jádra. Vyšetřovatelé nepotřebují vlastní protokol IBC, normálně: přezkum rekombinantní DNA u zvířat bude proveden na základě informací předložených prostřednictvím online objednání transgenního jádra, a bude přidán do protokolu IBC jádra jako změna, pokud bude schválen. IBC vás může kontaktovat pro další informace v rámci kontroly rDNA po odeslání objednávky. Před zahájením injekcí je nutné schválení IBC.

poděkování

• žádáme vás, abyste v seminářích a publikacích potvrdili případ transgenní a cílené zařízení.

Časová osa

• od data injekce buněk bude minimálně 6 týdnů před tím, než vám budeme schopni dodat myši (téměř 3 týdny těhotenství a nejméně 3 týdny postnatálního růstu před odstavením). Bude to dalších 6 týdnů, než budou samci chimér dostatečně staří na chov, a minimálně dalších 6 týdnů, než budete mít odstavené potomky na genotyp, aby otestovali přenos zárodečné linie-celkem 4.5 měsíců od injekce do testování přenosu zárodečných linií.
• aktuální (3/25/21) očekávaná doba mezi umístěním objednávky a injekcí es buněk je 8 týdnů. Během 8 týdnů před injekcí je žádost o chiméru přezkoumána výborem rDNA IBC, ES buňky jsou rozmrazeny a pěstovány a myši jsou objednány a přijaty.

úspěšnost při generování chimérických myší

jádro generuje v průměru asi 5 chimér na buněčnou linii.

Začínáme
pravděpodobnost přenosu zárodečné linie cílené mutace se zvyšuje s počtem dostupných nezávislých buněčných linií ES. V průměru asi dvě třetiny až tři čtvrtiny buněčných linií ES na 129 genetickém pozadí půjdou zárodečnou linií. Pro ES buněčné linie na pozadí C57 půjde průměrně pouze polovina až dvě třetiny řádků. Pokud tedy kupujete cílené linky es buněk z veřejného úložiště, doporučujeme zakoupit 3 nebo více správně cílených řádků na pozadí 129 a 4 nebo více řádků na pozadí C57. Podobně objednejte 2 nebo více injekcí pro 129 řádků a 3 nebo více pro řádky C57. Pro generování tkáňově specifických knockoutů s podmíněnými alelami v ES buňkách z EUCOMM, viz náš primer.

Často kladené otázky

co jsou chiméry?
typicky jsou chiméry konstruovány tak, aby generovaly myši z genově cílených nebo genově zachycených buněčných linií ES. ES buňky vstřikované do hostitelských embryí vedou k mozaikovým myším známým jako chiméry.
samčí ES buňky jsou injikovány do neexponovaných blastocyst. Pokud je hostitelské embryo ženské a samčí ES buňky vytvářejí zárodečné buňky, chiméra bude často plodným mužem. Používají se hostitelská embrya z kmene, který nebude příliš konkurovat ES buňkám, a obě složky (ES a hostitelské embryo) jsou geneticky označeny geny barvy srsti, takže příspěvek es buněk ke zvířeti lze snadno určit. Pokud je podíl potomků ES buněk v srsti zvířete vysoký, pravděpodobnost, že ES buňky jsou zastoupeny v gametách, je také vysoká, protože es buňky se důkladně promíchají s hostitelskými buňkami brzy v embryogenezi. Systém značení barev srsti také umožňuje pomocí vhodných křížů určit, zda potomci chimér pocházejí z buněčné složky ES nebo hostitelské embryonální složky.
129 es buněk vede k hnědé barvě srsti, protože jsou A/A (divoký typ Agouti) a hostitelská embrya C57BL / 6J vedou k černé barvě srsti, protože jsou a / a (recesivní nonagouti). ES buňky pocházejí ze 129 kmenů myší; hostitelská embrya pocházejí z kmene c57bl / 6J myší. Pokud jsou tyto chiméry chovány na A / a non-agouti myši (například C57BL / 6J, pak jakýkoli hnědý potomek (a/a) musí vzniknout z gamet odvozených z buněk ES a očekává se, že 50% hnědých potomků bude nést vyřazovací alelu. Alternativně může být přenos mutace testován přímo pomocí PCR nebo Southern blot testů tkání z potomstva.
pokud jsou ES buňky z kmene C57BL/6J (a/a, Tyr/Tyr a black), hostitelským embryem bude albino C57BL/6J (a/ a, Tyrc-2J / Tyrc2-J a bílá). Chov takových chimér na albino C57BL / 6J může generovat černé potomstvo (a/ a, Tyr / Tyrc-2J) z buněčné složky ES, z nichž 50% by mělo nést mutaci, a bílé potomstvo (a/a, Tyrc-2J/Tyrc-2J) z hostitelské embryonální složky.

samčí chiméry, které pravděpodobně přenášejí cílenou mutaci, lze identifikovat genotypizací kopulační zástrčky.

chiméry pro jiné účely
vyrábíme také agregační chiméry a diploidní chiméry. Dvě preimplantační embrya ze dvou různých kmenů myší jsou kombinována za vzniku agregační chiméry. Tato technologie může být použita pro generování genetických mozaikových embryí pro analýzu autonomie a neautonomie genového působení a dalších experimentálních cílů. V diploidtetraploidních chimérách tetraploidní složka do značné míry vede k velké části placenty odvozené od embrya a diploidní složky k embryu. Tento typ chiméry lze použít k určení, zda je v placentě nebo embryu vyžadován gen.

proč jsou moje myši vtipné barvy?
některé buněčné linie ES jsou heterozygotní pro alely barvy srsti, které se projevují pouze v následujících generacích. Buňky R1 129 ES, které používáme, jsou heterozygotní v Albino lokusu, nesoucí jednu kopii činčilové alely Albína (cch, také označované Tyrc-ch)a jsou heterozygotní v růžovookém ředicím lokusu (p). Chov potomků pocházejících z buněk R1 ES k sobě může vést k myším, které jsou černé, různé odstíny šedé, různé odstíny hnědé nebo žluté, v závislosti na sortimentu barev srsti alel.

co lze udělat pro zajištění přenosu zárodečných linií?
přenos zárodečné linie je maximalizován pomocí es buněk, které strávily minimální množství času v kultuře, které mají normální doplněk chromozomů a které neobsahují kvasinky, bakterie a mykoplazmy. Zaměřte se na buněčnou linii, o které víte, že je přenášena za vašich podmínek ve vaší instituci. Použijte rodičovskou buněčnou linii, která je na nejnižším dostupném čísle průchodu (nejlépe menším než číslo průchodu 16). Minimalizujte dobu kultivace cílené linie. Ověřte, že cílené buněčné linie mají normální počet chromozomů. Otestujte svou buněčnou linii na mykoplazmu. Některé buněčné linie nebudou přenášet, i když jsou všechny tyto parametry ve váš prospěch. I za optimálních podmínek budou přes zárodečnou linii přenášeny pouze dvě třetiny cílených buněčných linií ES. Proto začněte alespoň třemi nezávislými cílenými buněčnými liniemi, abyste zajistili přenos.

mám slabé chiméry / ženské chiméry. Budou vysílat knockout?
slabé chiméry i ženské chiméry mohou přenášet mutantní alely, i když zřídka. Samčí chiméry, které pravděpodobně přenášejí cílenou mutaci, lze identifikovat genotypizací kopulační zástrčky. Pouze asi 10% ženských chimér přenáší genom es buněk, když tak učiní, je to jen v prvních několika vrzích a mnoho z jejich mužských potomků má pohlavní chromozomové aneuploidie, které je činí neplodnými (Bronson et al ., 1995 PNAS 92, 3120 ).

proč zemřely mé nejsilnější chiméry?
úmrtnost se může zvýšit s podílem zvířete, které pochází z ES buněk, a to i pro nejlepší buněčné linie. Tato úmrtnost je do značné míry způsobena epigenetickými aberacemi, které vznikly v kultuře. Předpokládá se, že epigenetické aberace jsou korigovány následným chovem přežívajících myší, a náhodně by se oddělili od cíleného lokusu, i kdyby tomu tak nebylo.

na jaký kmen myší chovám své mutanty?
aby se minimalizovala genetická variabilita co nejrychleji, chiméry se chovají na stejném pozadí jako es buňky. Pokud by ES buňky byly 129, chovejte chiméry na 129 myší a vaše mutace bude v jednom kroku zcela na 129 inbredním pozadí. Nejběžnějším inbredním pozadím pro genetické studie je kmen C57BL/6. Pokud jsou vaše ES buňky C57BL / 6, zkřížte své chiméry na myši C57BL/6J. Pokud chcete změnit pozadí, standardem je provést 9 sériových křížů na inbrední kmen volby (asi 2,5 roku). Zdůvodnění pro 9 generace zde vysvětluje Lee Silver. Alternativně, přibližně polovina počtu generací je vyžadována backcrossem podporovaným markerem, nebo speed congenics.Pro maximální reprodukci zkřížte myši na outbrední kmen, jako je CD1. Myši CD1 byly odvozeny od švýcarských myší, mají vysoký stupeň genetické variability a byly vybrány pro robustní reprodukci.

ES buňky s podmíněnými alelami z EUCOMM
každá buněčná linie z EUCOMM bude vyžadovat, abyste dokončili smlouvu o převodu materiálů. Spusťte tento proces co nejdříve.
doba generování myší a počet křížů potřebných k vytvoření experimentálních myší se kombinují s délkou času, která je překvapivá pro ty, kteří nejsou zvyklí na genetiku myší, takže plánujte dopředu. Doba generace myší (doba od sexuálně zralého dospělého až po pohlavně zralé potomky) je asi 3 měsíce.
podmíněné alely EUCOMM mají obvykle kazetu lemovanou Frt (kazetu“ Frt-ed“). Kazeta má Spojkový akceptor, který odvádí prakticky veškeré sestřihování do kazety, takže alela je v této konfiguraci mutací ztráty funkce. Aby se vytvořila podmíněná alela, musí být kazeta lemovaná Frt odstraněna přechodem na myši exprimující Flpe. Systém Flpe / Frt je srovnatelný, ale odlišný od systému Cre/LoxP.
vstříkneme ES buňky do hostitelských embryí, abychom vytvořili chimérické myši. Odtud budete chovat myši, abyste vytvořili myši nesoucí mutaci (přenos zárodečné linie). Tato zakladatelská generace myší může být zkřížena na myši, které exprimují Flpe, aby odstranily kazetu Frt-ed, generování podmíněné alely. Pak musíte udělat několik dalších křížů, abyste vytvořili experimentální myši.

1. od injekce es buněk po dospělé sexuálně zralé chiméry je doba generace myší (3 měsíce).
2. chiméry jsou chovány na myši divokého typu, aby se vytvořil mutant v zárodečné linii (3 měsíce).
3. heterozygotní podmíněné myši frtd jsou zkříženy na Flpe exprimující homozygoty. To generuje Flpe / o, frtd podmíněné / + potomstvo. (3 měsíce)
4. myši Flpe / o, frtd podmíněné / + jsou zkříženy na divoký typ, aby se stanovila vyříznutá alela v zárodečné linii a rozmnožila se Flpe, a excize je molekulárně ověřena u těchto podmíněných / + myší (3 měsíce).
5. podmíněné / + myši se pak navzájem chovaly, aby vytvořily homozygotní podmíněné alely myší (3 měsíce).
6. podmíněné / podmíněné myši jsou chovány na tkáňově specifické-Cre / tkáňově specifické-Cre, null/+ myši, aby se experimentálně specifické-CRE/ o, podmíněné / null myši a kontrolní tkáňově specifické-Cre/o, podmíněné/+ myši.

kromě toho je třeba získat myši Fple, null, Cre, chovat myši specifické pro tkáň-CRE/tkáňově specifické-Cre, null/+.
také by měla být analyzována podmíněná alela, aby se zjistilo, zda je funkce divokého typu před excizí s Cre a null po excizi s Cre. K určení, zda je podmíněná alela ve funkci divokého typu před excizí, by měly být vyšetřeny podmíněné/podmíněné a podmíněné/nulové mutanty, aby se zjistilo, zda je jejich fenotyp stejný jako myši +/+ a null/+. Aby se zjistilo, zda je podmíněná vyříznutá alela nulová, je podmíněná zkřížena na zárodečnou Cre myš a vyříznuté podmíněné jsou intercrossed, aby se ověřilo, zda je fenotyp excised conditional / excised conditional shodný s null / null a / nebo že z vyříznuté podmíněné alely není vyroben žádný protein.
reportér aktivity Cre jako RosaReporter, nebo ideálněji, který přímo ukazuje, že sledovaný protein chybí v cílových buňkách imunofluorescencí, je důležitou kontrolou. RosaReporter vytváří permanentní expresi beta-galaktosidázy ve všech buňkách, které byly vystaveny Cre.
nadměrná exprese Cre může vést k zlomení chromozomů, což může způsobit fenotypy nesouvisející s funkcí podmíněné alely. Proto jsou sourozenecké myši, které exprimují Cre, ale zachovávají si určitou genovou funkci (například podmíněné/+), důležitou kontrolou.