1.4.1 homogenizační médium
cell disruption se obvykle provádí buď v mírně hypo-osmotickém nebo iso-osmotickém médiu, aby se zachovala morfologická integrita. Sacharóza se běžně používá jako osmotikum k prevenci subcelulárních organel nebo vezikul před nepříznivým otokem nebo smrštěním. Mannitol a sorbitol byly také použity, pokud bylo zjištěno, že sacharóza interferuje s biochemickou analýzou subcelulární složky. Sacharóza je upřednostňována před solnými roztoky, protože tyto mají tendenci agregovat subcelulární organely. Hypo-osmotická média se často používají při izolaci frakcí plazmatické membrány, protože za těchto podmínek narušené buňky produkují plazmatické membrány ve formě velkých duchů nebo listů. To významně snižuje vysoký stupeň variability velikosti těchto fragmentů před centrifugací. Ačkoli homogenizační médium je obvykle vodné povahy, nevodná média, jako je ether/chloroform, byla použita k izolaci subcelulárních organel. Nevodná média však mohou inaktivovat některé enzymy a snížit morfologickou integritu některých tkání.
chelatační činidla (EDTA nebo EGTA) mohou být přidána do homogenizačního média, aby se odstranily dvojmocné kationty, jako je Mg2+ nebo Ca2+, které jsou vyžadovány membránovými proteázami. Je důležité poznamenat, že inhibitory proteázy by měly být stále zahrnuty do média, protože EDTA a thiolová činidla mohou aktivovat některé proteolytické enzymy. Mnoho enzymů membránových markerů však vyžaduje tyto kationty pro aktivitu a mohou být inhibovány po odstranění kationtů z extraktu. Přidání Mg2 + nebo Ca2+ do homogenizačního média udržuje jadernou integritu. Tyto ionty však mohou způsobit agregaci membrány a snížit kontrolu dýchání v mitochondriích.
buněčné narušení rostlinné tkáně často uvolňuje fenoly, které mohou mít několik škodlivých účinků na rostlinné enzymy. Rostlinné fenolické sloučeniny zahrnují v podstatě dvě skupiny: fenylpropanoidní sloučeniny (např. hydrolyzovatelné taniny) a flavonoidy(např. kondenzované taniny). Fenoly mohou vodíkové vazby s peptidovými vazbami proteinů, nebo podstoupit oxidaci fenoloxidázou na chinony. Chinony jsou silná oxidační činidla, která mají také tendenci polymerovat a kondenzovat s reaktivními skupinami proteinů za vzniku tmavého pigmentu zvaného melanin, který tvoří základ zhnědnutí rostlinné tkáně. Připojení melaninu k proteinům může inaktivovat mnoho enzymů. Fenolické hydroxylové skupiny mohou tvořit iontové interakce se základními aminokyselinami proteinů nebo interagovat hydrofobně s hydrofobními oblastmi proteinů. Proto je důležité co nejrychleji odstranit fenolické sloučeniny, a toho je nejlépe dosaženo použitím adsorbentů, které se vážou na fenoly nebo chinony, nebo použitím ochranných látek, jako je boritan, germanát, siřičitany a merkaptobenzothiazol, které inhibují aktivitu fenoloxidázy. Fenol adsorbent, polyvinylpyrrolidon buď ve vodě rozpustné formě, nebo jako vysoce zesíťovaný nerozpustný produkt „Polyclar“ může být přidán do izolačního média. Polyvinylpyrrolidon váže ty fenolické sloučeniny, které tvoří silné vodíkové vazby s proteiny. Bylo také hlášeno, že bovinní sérový albumin reaguje s rostlinnými fenoliky a je také účinným vychytávačem chinonu.
frakcionace buněk nebo tkání se vždy provádí při +4°C, aby se snížila aktivita membránových proteáz. Proteázy lze rozdělit na endopeptidázy a exopeptidázy. Endopeptidázy, které jsou enzymy, které štěpí vnitřní peptidové vazby, zahrnují: kyselé proteázy, které mají pH optima ph 2,5-3,8 a mohou být inhibovány inhibitorem přechodného stavu pepstatin; serinové proteázy, které mohou být inhibovány diisopropylfluorofosfátem a fenylmethylsulfonylfluoridem; a sulfhydrylové proteázy, které jsou inhibovány N-ethylmaleimidem nebo E-64 (l-trans-epoxysukcinyl-leucylamid-butanem). Příklady exopeptidáz zahrnují karboxypeptidázy, které jsou přítomny ve většině rostlinných tkání a snadno hydrolyzují většinu C-terminálních aminokyselin. Všechny dosud studované rostlinné karboxypeptidázy jsou inhibovány diisopropylfluorofosfátem. Aminopeptidázy, dipeptidázy a tripeptidázy byly také identifikovány v rostlinách. Mezi další sloučeniny používané v homogenizačním médiu patří činidla redukující disulfidy, jako je 2-merkaptoethanol, dithiothreitol, dithioerythritol, redukovaný glutathion nebo cystein. Je to proto, že mnoho enzymů obsahuje esenciální sulfhydrylovou skupinu aktivního místa, která musí zůstat snížena, aby se udržela enzymatická aktivita. Mnoho problémů izolace organel je spojeno s prasknutím křehkých membrán, například tonoplastu obklopujícího vakuolu. Kromě fyzické destrukce těchto membrán obsahují rostlinné tkáně aktivní lipolytické enzymy, které mohou přímo napadat lipidové složky membrán a narušit organely. Volné mastné kyseliny uvolňované hydrolytickým účinkem acylhydroláz mohou inhibovat atpázové aktivity mitochondrií, chloroplastu a plazmatické membrány. Jiné škodlivé účinky mastných kyselin jsou také dobře zavedeny. Existují určité podmínky, které mohou snížit odbourávání lipidů lipázami a lipolytickými acylhydrolázami v rostlinách. Patří sem použití (1) izolačního média s pH 7.5-8, při které většina lipolytických enzymů a lipooxygenáz vykazuje malou aktivitu, (2) chelatační činidla, jako je EDTA, protože mnoho fosfolipáz je závislých na Ca2+; mnoho lipolytických enzymů však není ovlivněno chelatačními činidly a (3) dalšími přísadami, jako jsou antioxidanty, aby se zabránilo oxidačnímu rozkladu hydroperoxidů mastných kyselin, disulfidových redukčních činidel, specifických inhibitorů enzymů a použití hovězího sérového albuminu bez mastných kyselin, který váže volné mastné kyseliny. Každé jednotlivé homogenizační médium je odlišné a může obsahovat specifické inhibitory enzymů, jako jsou fosfolipázy nebo fosfatázy. Glycerol se například často přidává do izolačního média, aby inhiboval fosfatázu kyseliny fosfatidové. Ethanolamin a cholin chlorid se běžně používají k inhibici fosfolipázy D.
pufrační kapacita homogenizačního média pro frakcionaci rostlinných buněk musí být vysoká, aby se vyrovnalo uvolňování organických kyselin narušenou vakuolou, která tvoří podstatný objem buňky. Homogenizační médium může být formulováno empirickým hodnocením nebo racionální analýzou. Například, aby se zajistilo, že příslušný purifikovaný protein zůstane neporušený, mohou být do homogenizačního média přidány všechny hlavní inhibitory proteáz nebo mohou být alternativně kopírovány fyziologické roztoky. Protože cytoplazmatické pH rostlinné buňky je kolem 7,5-8,0, mělo by homogenizační médium odrážet fyziologický stav buňky, a proto je slabě pufrováno na cytoplazmatické pH.