aplikace systému Cobas 4800 pro detekci vysoce rizikového lidského papilomaviru u 5650 asymptomatických žen

Abstrakt

testování vysoce rizikového papilomaviru (HR-HPV) v kombinaci s cytologií zlepšuje detekci cervikálních lézí a prodlužuje délku screeningových intervalů. Pro populační průzkum HR-HPV je automatizace testování velmi potřebná. Testovací systém Cobas 4800 HPV je plně automatizovaný test, který může současně detekovat HPV16, HPV18 a dalších 12 sdružených genotypů HR-HPV. Tento systém byl použit pro HR-HPV screening v řadě zemí; nicméně, taková aplikace u velké populace v Číně nebyla zdokumentována. V této studii jsme použili testovací systém Cobas 4800 HPV k detekci HR-HPV ve vzorcích cervikální cytologie odebraných od celkem 5650 asymptomatických žen z oblasti jižní Číny. Hlásili jsme následující: (1) prevalence 14 genotypů HR-HPV byla 12,96%; (2) u osob s infekcí HR-HPV bylo 2,25% pozitivních na HPV16, 0,50% na HPV18, 9,15% na sdružených 12 typů HPV a 1,06% na mnohočetnou infekci HPV; a (3) Nebyl žádný významný rozdíl v prevalenci HR-HPV mezi různými věkovými skupinami. HPV16 a HPV18 se ukázaly jako převládající typy HPV nalezené u pacientů s rakovinou děložního čípku v některých oblastech v Číně, což naznačuje, že plně automatizovaný test, jako je testovací systém Cobas 4800 HPV, je zvláště cenný pro populační screening HR-HPV v těchto oblastech, protože tento test může současně detekovat HPV16 a HPV18.

1. Úvod

lidský papilomavirus (HPV) je dvouvláknový DNA virus z čeledi Papilomaviridae . Bylo identifikováno více než 200 genotypů HPV, mezi které patří 15 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, a 82) jsou vysoce spojeny s rakovinou děložního čípku . Rakovina děložního čípku je čtvrtou nejčastější rakovinou u žen na celém světě a šestou nejčastější rakovinou u žen v Číně . Pro snížení zátěže rakoviny děložního čípku má prvořadý význam včasná identifikace cervikálních lézí, které pravděpodobně postupují k invazivní rakovině. Cervikální cytologie hraje důležitou roli v prevenci rakoviny děložního čípku . Přidání HPV testování do cytologie má za následek zvýšenou detekci vysoce kvalitních cervikálních lézí, a proto se doporučuje, aby byl screening vysoce rizikového HPV (HR-HPV) začleněn do cytologie, aby se zlepšila detekce onemocnění a prodloužila se délka screeningových intervalů .

k dnešnímu dni byly hlášeny různé metody pro genotypizaci a detekci HPV . Pro populační screening je automatizace testování obzvláště užitečná, protože automatizace má schopnost zpracovat velké množství vzorků v krátkém čase a snížit lidské chyby, ke kterým může dojít při ručních operacích. Testovací systém Cobas 4800 HPV (Roche Molecular Systems Inc., Rotkreuz, Švýcarsko), plně automatizovaný, je navržen tak, aby současně detekoval celkem 14 typů HPV: HPV16 jednotlivě, HPV18 jednotlivě a 12 sdružených genotypů HR-HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, a 68). Tento systém byl schválen americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv pro HR-HPV screening. Testovací systém Cobas 4800 HPV se skládá ze 2 částí, tj., nástroj Cobas x 480, který se používá pro automatizaci čištění nukleových kyselin a pipetování vzorků PCR a analyzátor Cobas z 480, který je určen pro automatickou amplifikaci PCR v reálném čase a následnou typově specifickou hybridizaci. Ačkoli použití systému Cobas 4800 pro testování HR-HPV bylo hlášeno v řadě zemí, takové použití u velké populace v Číně nebylo zdokumentováno. V této studii jsme použili testovací systém Cobas 4800 HPV k detekci HR-HPV ve vzorcích cervikální cytologie odebraných od celkem 5650 asymptomatických žen.

2. Metody

tato studie byla schválena Výborem pro přezkum lékařského výzkumu nemocnice Zhongshan pro tradiční čínskou medicínu. Informovaný souhlas byl získán od všech účastníků.

2.1. Odběr cervikálních vzorků

asymptomatické ženy ve věku 20-65 let byly zařazeny od ledna 2018 do prosince 2018 do této studie s náklady na testování hrazenými studijními subjekty nebo jejich zaměstnavateli nebo v kombinaci. Kritéria pro zařazení zahrnují být 20 roky nebo starší, být těhotná, mít neporušenou dělohu, být sexuálně aktivní, nebo mít v anamnéze sexuální aktivitu. Všechny subjekty byly informovány o tom, že nepoužívají vaginální léky, vaginální antikoncepci nebo lubrikanty po dobu 48 hodin před odběrem děložního čípku. Vzorky cervikální cytologie byly odebrány pomocí kombinovaného zařízení Cervex-Brush (Rovers Medical Devices)následujícím způsobem: endocervikální část vzorku zařízení byla vložena do endocervikálního kanálu, aby se laterální štětiny mohly plně dotýkat ektocervixu, a zařízení bylo poté otočeno o dvě plné otáčky ve směru hodinových ručiček. Po odebrání bylo zařízení s odebranými buňkami okamžitě vloženo do injekční lahvičky obsahující roztok PreservCyt (Hologic Inc., Bedford, MA, USA) a rázně vířil. Vzorky byly použity pro detekci HPV DNA, jak je popsáno níže.

2.2. Detekce HR-HPV pomocí testovacího systému Cobas 4800 HPV

lyzační pufr, promývací pufr, eluční pufr, HPV pozitivní a negativní kontrolní soupravy a všechna ostatní činidla byla zakoupena od společnosti Roche Molecular Systems Inc. Každý vzorek měl vnitřní kontrolu, β-globin, pro sledování buněčné přiměřenosti, a každý běh zahrnoval sadu HPV pozitivních a negativních kontrol. Extrakce a čištění DNA byly prováděny pomocí nástroje Cobas x 480 podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, vzorky roztoku PreservCyt byly vířeny a umístěny na nosič vzorku a činidla, např. Lýzový pufr, promývací pufr a eluční pufr, byly vloženy do příslušných nosičů zásobníků činidla. Po naplnění vzorku a činidla byla příprava DNA dokončena automaticky a konečné produkty DNA byly odebrány do mikrovlnné desky. Následně byla microwellová deska obsahující DNA ručně utěsněna a naložena na analyzátor Cobas z 480 a amplifikace a hybridizace byly dokončeny automaticky.

2.3. Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí SPSS 13.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Test χ2 byl použit k posouzení kategorických proměnných. Všechny statistické testy byly 2stranné a hodnoty menší než 0,05 byly považovány za statisticky významné.

3. Výsledky

celkem 5650 asymptomatických žen ve věku 20-65 let s průměrným věkem let splnilo požadavek studie a bylo zahrnuto do této studie. Z těchto účastníků bylo 732 (12,96%) zjištěno jako HR-HPV-pozitivní, včetně 127 (2,25%) s HPV16 infekcí, 28 (0,50%) s HPV18, 517 (9,15%) se sdruženými 12 typy HPV a 60 (1,06%) s vícenásobnou HPV infekcí (HPV16 smíchaný s HPV18, HPV16 smíchaný s 12 sdruženými typy, HPV18 smíchaný s 12 sdruženými typy nebo HPV16 smíchaný s HPV18 a 12 sdruženými typy) (Tabulka 1).

podle věku byli účastníci rozděleni do 4 skupin: 20-30, 31-40,41-50 a >51 let. Jak je uvedeno v tabulce 2, skupina 31-40 let měla nejvyšší míru infekce HR-HPV 15,32% následovanou skupinami >50 let, 41-50 let a 20-30 let, ačkoli nebyla pozorována žádná statistická významnost mezi mírou infekce těchto skupin.

4. Diskuse

v této studii jsme použili systém Cobas 4800 k detekci HR-HPV u 5650 asymptomatických žen a zjistili jsme následující: (1) prevalence 14 genotypů HR-HPV byla 12,96%; (2) ze 732 HR-HPV pozitivních žen bylo 2,25% pozitivních na HPV16, 0,50% na HPV18, 9,15% na sdružených 12 typů HPV a 1,06% na mnohočetnou HPV infekci; a (3) Nebyl žádný významný rozdíl v prevalenci HR-HPV mezi různými věkovými skupinami.

jak test HPV v reálném čase s vysokým rizikem od společnosti Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, IL, USA) a testovací systém Cobas 4800 HPV jsou klinicky validované, plně automatizované testy založené na PCR pro detekci HR-HPV . Jednou z výhod těchto 2 testů je, že mohou současně detekovat a rozlišit HPV16 a HPV18, což je důležité pro screening rakoviny děložního čípku, protože HPV16 a HPV18 představují přibližně 70% rakoviny děložního čípku na celém světě . Jen málo studií porovnalo tyto 2 testy při detekci HR-HPV v klinických vzorcích. Park a kol. testováno 365 vzorků cervikálního výtěru a uvedlo, že HPV Test s vysokým rizikem v reálném čase vykazoval citlivost 78,3% se specificitou 99,2% , zatímco citlivost a specificita systému Cobas 4800 byly 91,7% a 97,0%. Cuzick et al. prověřeno 6000 žen a ukázalo se, že 16,0% bylo zjištěno, že je HR-HPV-pozitivní systémem Cobas 4800, zatímco 13,4% bylo zjištěno, že je HR-HPV-pozitivní testem HPV s vysokým rizikem v reálném čase . Tyto údaje naznačují, že systém Cobas 4800 má větší detekční citlivost.

několik klinicky validovaných molekulárních systémů pro detekci HR-HPV DNA zahrnula Světová zdravotnická organizace v roce 2016 do příručky integrující testování HPV v programech screeningu rakoviny děložního čípku-Příručka pro manažery programů (https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2016/manual-VPH-English—FINAL-version.pdf). Tyto testy se skládají z hybridizačních testů, tj. techniky Hybrid Capture 2 a testu CareHPV, a testů založených na PCR, např., test Cobas HPV, test Abbott Realtime High Risk HPV, test Cervista HPV HR a test BD HPV. Všechny testy založené na PCR vyžadují izolaci DNA, zatímco testy založené na hybridizaci ne. Ze všech metod trvá Cervista HPV HR Test 6-7 hodin a Abbott RealTime High Risk HPV test trvá 6-8 hodin, což nemusí splnit cíl „vidět a léčit“ ve stejný den. Naproti tomu všechny ostatní metody včetně systému Cobas 4800 však vyžadují maximální dobu běhu přibližně 5 hodin, což je vhodné pro pacienty, aby dokončili „vidění a léčbu“ při jedné návštěvě.

celosvětově se prevalence HR-HPV liší od kontinentu k kontinentu . V Číně byly pro průzkum prevalence HR-HPV použity různé metody . Wu a kol. použil test Hybrid Capture 2 (Qiagen, Hilden, Německo) pro detekci HR-HPV 13 sdružených typů (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, a 68) Celkem 4215 žen ve věku 17-54 let z 5 různých zeměpisných oblastí Číny a zjistilo, že prevalence HR-HPV byla 12,4% . Použití stejné metody jako Wu et al. , Zhao a kol. zjistil, že 15.2% z 1274 žen z regionu v severní Číně bylo pozitivní na HR-HPV . Chen et al. zaměstnal HPV genotypovou soupravu (Yaneng Biotechnology Limited Corp., Shenzhen, Čína) pro celkem 961,029 HPV testy pro ženy ve věku 16 až 83 let z jihovýchodní Číny a odhalil míru infekce HR-HPV 16.61%. Jing et al. aplikován hmotnostní spektrometrický test pro testování HPV-DNA u 78,355 žen ve věku 18 až 75 let z jižní Číny a hlášeno <7,3% míra prevalence HR-HPV . Tyto studie prokazují míru infekce HR-HPV v rozmezí přibližně 10-15% u čínských žen, což je v souladu s naším zjištěním. Metoda, kterou jsme použili v této studii, je však jednodušší a méně pracná ve srovnání s metodami používanými v předchozích šetřeních .

dvě studie s největší velikostí vzorku provedené v Číně porovnávaly míru prevalence HR-HPV mezi věkovými skupinami. Zeng et al. retrospektivně analyzoval 671 163 HPV testů provedených metodou Hybrid Capture 2 v letech 2007 až 2014 a prokázal nejvyšší prevalenci HR-HPV 36.9% ve věkové skupině <20 let, zatímco míra HR-HPV pozitivní pro věkové skupiny 20-30, 30-40 a 40-50 let byla 24,4%, 19,7% a 19,9%. Testování HR-HPV s největší velikostí vzorku (961,029 vzorků) provedené Chen et al. opět ukazuje nejvyšší míru prevalence HR-HPV ve věkové skupině <20 let (22,3%), zatímco míra prevalence pro věkové skupiny 20-30, 30-40 a 40-50 let je 16,8%, 15,2% a 15,9%. Tyto studie ukazují mírně vyšší míru prevalence ve skupině 20-30 let než ve skupinách 30-40 a 40-50 let, což je v kontrastu s našimi výsledky, protože jsme pozorovali nejnižší prevalenci HR-HPV ve skupině 20-30 let. Tento rozpor může nastat v důsledku následujících faktorů: (1) mladší ženy mají v dnešní době větší přístup k programům výchovy ke zdraví, zejména k online programům používajícím elektronická zařízení, a (2) mladší ženy touží učit se a přijímat nové znalosti o hygieně a sexuálním zdraví.

HPV16 je nejběžnějším typem HR-HPV nalezeným v cervikálních vzorcích žen ze severu (Peking a Henan, Shanxi a provincie Xinjiang), jihovýchodu (provincie Šanghaj a Zhejiang) a jižní Číny (provincie Guangdong), s pozitivní mírou v rozmezí od 1,5 do 3,6%, což je v souladu s 2,25% mírou infekce HPV16 pozorovanou u našich studovaných subjektů, které pocházejí z jižní Číny. HPV16 je celosvětově zodpovědný za přibližně 50% rakoviny děložního čípku . Zatímco informace o distribuci genotypu HR-HPV u čínských pacientů s rakovinou děložního čípku jsou stále omezené, Li et al. hlásil, že 1818 z 2309 pacientů s rakovinou děložního čípku (78,7%) ze západní Číny byly pozitivní na HPV16, a přibližně 90% z těchto pacientů byly pozitivní na HPV16 a HPV18 . 53,2% míra infekce HPV16 a HPV18 byla také prokázána u 326 pacientů s rakovinou děložního čípku z provincie Fujian v jihovýchodní Číně . Tyto údaje naznačují, že HPV16 a HPV18 jsou převládajícími typy HPV, které se vyskytují u pacientů s rakovinou děložního čípku v těchto oblastech. Plně automatizovaný test, jako je testovací systém Cobas 4800 HPV, který může současně detekovat a diferencovat HPV16 a HPV18, bude zvláště cenný pro populační screening HR-HPV v regionech, které mají dominanci infekce HPV16 a HPV18.

dostupnost dat

údaje použité na podporu zjištění této studie jsou k dispozici od příslušného autora na vyžádání.

střet zájmů

autoři prohlašují, že nemají žádný střet zájmů.

příspěvky autorů

SW, XH, QP a LZ přijaly účastníky, odebraly vzorky a provedly testování. SW a JZ napsali článek. FM přezkoumala literaturu a provedla statistickou analýzu. JZ navrhl studii, analyzoval data a nakonec rukopis schválil.