aktivace ClpP proteázy je výsledkem reorganizace elektrostatických interakčních sítí u vstupních pórů

vazebný režim ACP1 na EcClpP

k objasnění strukturního základu pro aktivaci ClpP pomocí ACP128, struktur NmClpP a EcClpP (obr. 1a) v komplexu s analogy ACP1 byly hledány. Zatímco struktura nmclpp s vázaným ACP1 nebyla dosažena navzdory opakovaným pokusům, struktura komplexu EcClpP+ACP1-06 byla stanovena na rozlišení 1,9 Å (obr. 1b, c, tabulka 1), obsahující tetradekamer v asymetrické jednotce (řetězce A-N). Hustota elektronů pro n-koncové zbytky, které tvoří axiální smyčky EcClpP, je nejasná ve všech kromě jedné podjednotky (řetězec B). V dříve publikovaných strukturách jsou tyto axiální smyčky vysoce pružné a jsou obvykle neuspořádané v krystalu v nepřítomnosti aktivátorů nebo prostřednictvím vyloučení krystalovým obalením23. Jednoznačná elektronová hustota byla pozorována pro jednu molekulu ACP1-06 v kapse tvořené podjednotkami D A E, ukazující dvě různé konfigurace sloučeniny (obr. 2a, b). Obě konfigurace byly modelovány v elektronové hustotě, ve které první konfigurace umístí trifluormethylpyridinovou část sloučeniny do hydrofobní kapsy (konfigurace dolů), zatímco druhá ji umístí ven z hydrofobní kapsy vystavené rozpouštědlu (konfigurace nahoru) (obr. 2a). Zbývajících 13 hydrofobních kapes vykazuje nejednoznačnou elektronovou hustotu pro ACP1-06. Modelovali jsme a rafinovali všech 14 molekul ACP1-06 v konfiguracích nahoru i dolů při obsazení 0,5, což vedlo ke zlepšení elektronové hustoty pro každý ligand.

vazebné režimy acp1-06 (obr. 2b-d) přibližné hodnoty Adepů pozorovaných v krystalových strukturách různých bakteriálních Clpp (obr. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Všimněte si, že sloučeniny syntetizované naší skupinou jsou číslovány jako ACP1-YY a ADEP-YY, zatímco sloučeniny ze studií jiných skupin jsou pojmenovány jako v příslušných publikovaných dokumentech. Všechny proteinové kontakty s ACP1-06 jsou nepolární povahy, s výjimkou dvou pozoruhodných elektrostatických vazeb, které se vyskytují mezi (1) fenolickým hydroxylovým postranním řetězcem Y76 a amidovým kyslíkem ACP1-06, a (2) guanidinylovým postranním řetězcem R206 (předposlední Arg v EcClpP) a sulfonylovým kyslíkem ACP1-06 (obr. 2b). Poslední dvě interakce jsou přítomny v obou konfiguracích ACP1-06. Kromě toho je R206 (řetězec E) stabilizován iontovou vazbou s E65 sousední podjednotky (řetězec D) (obr. 3a, b).

v dolní konfiguraci zabírá trifluormethylpyridinová část ACP1-06 hydrofobní dutinu tvořenou L62, T93 a F96 (řetězec D) a Y74, Y76, I104, L203 a L128 (řetězec E) (obr. 2b a 3b). Jedná se o stejnou dutinu obsazenou kruhem exocyklického zbytku Phe různých analogů ADEP kokrystalizovaných ClpP, jako je tomu v našem NmClpP+ADEP-0419 (obr. 2e, f) nebo struktury EcClpP+ADEP140 (obr. 2c, d). Naproti tomu v konfiguraci up se trifluormethylpyridinová část otáčí kolem vazby C-S a je vystavena rozpouštědlu při vytváření van der Waalsových kontaktů s Y74 ,I104, F126 a L203 (řetězec E) (obr. 2b a 3b). Gem-dimethylová část se hromadí proti plochému kruhu Y74 (řetězec E), zatímco prodloužený alifatický řetězec zakončený fenylovým kruhem substituovaným ortho-chlorem sedí v nepolární drážce mezi dvěma šroubovice ze sousedních podjednotek (obr. 3b). Tato vazebná štěrbina je tvořena L62 (řetězec D), F63 (řetězec D), A66 (řetězec D), L37 (řetězec E), V42 (řetězec E) a nepolární částí E40 (řetězec E) (obr. 2b a 3b).

v obou strukturách ecclpp vázaných na ACP1-06 a ADEP1 se nachází intrasubunitní solný most mezi R36 a E40, kde blízký alifatický ocas ADEP1 nebo chlorem substituovaný fenylový kruh ACP1-06 vytváří hydrofobní interakci s postranním řetězcem E40 (obr. 3b, c). Oba aktivátory jsou dále stabilizovány v hydrofobním místě dvěma odlišnými vzory vodíkových vazeb. Zatímco ACP1-06 je zajištěn iontovou interakcí vystavenou rozpouštědlem mezi jeho sulfonylovou skupinou a zbytkem C-terminálu R206 (obr. 3b), ADEP1 je držen na místě dvěma vodíkovými vazbami s hydroxylovou skupinou Y76 izolovanou uvnitř hydrofobního místa (obr. 3c). Vodíková vazba zprostředkovaná rozpouštědlem mezi E65 a karbonylovou skupinou postranního řetězce N-acyl Phe ADEP1 dále posiluje jeho interakci s EcClpP (obr. 3c). Tato extra vodíková vazba, stejně jako větší velikost cyklického depsipeptidového kruhu, který má větší plochu povrchu, se kterou tvoří van der Waalsovy interakce ve srovnání s menší trifluormethylpyridinovou skupinou ACP1, může představovat obecně těsnější vazbu pozorovanou pro ADEPs než ACP1s28.

ve struktuře EcClpP + ACP1-06 jsme našli nevysvětlitelnou elektronovou hustotu ve všech 14 podjednotkách vycházejících z nukleofilního zbytku S111 katalytické triády, což naznačuje kovalentní modifikaci (Doplňkový obr. 1a, b). Hustota se rozprostírá přibližně v pravém úhlu v opačných směrech od bočních řetězů S111. Navzdory rozsáhlému úsilí nemohl být přesvědčivě vybaven peptidy, acylketonovými produkty nebo různými známými molekulami inhibitoru serinové proteázy.

vazebný režim ADEP na NmClpP

NmClpP má kratší pro-sekvenci na n-konci, zatímco má čtyři další zbytky na C-konci ve srovnání s EcClpP (obr. 1a). Ačkoli byl NmClpP exprimován jako celovečerní protein nesoucí N-terminální his6-tag, opakovaně jsme pozorovali nedostatek vazby na pryskyřici kyseliny Ni-nitrilotrioctové. N-terminální sekvenování purifikovaného proteinu ukázalo, že zralý NmClpP začíná na zbytku Y6 (obr. 1a), indikující autoproteolýzu k uvolnění její n-koncové pro-sekvence (1MSFDN5).

dříve jsme určili strukturu NmClpP pomocí ADEP-0419. V této studii jsme určili strukturu apo-NmClpP na 2,0 Å a NmClpP s vazbou ADEP-14 na 2,7 Å (obr. 1b, c, Doplňkový obr. 1C, Tabulka 1). Struktura apo-NmClpP obsahuje tetradekamer v asymetrické jednotce a nevykazuje žádnou jasnou hustotu pro žádnou ze 14 N-koncových axiálních smyček. Slabá elektronová hustota je pozorována pro smyčky tvořené zbytky G133-G137 v řetězci β8 oblasti rukojeti (obr. 1a). Asymetrická jednotka krystalu NmClpP+ADEP-14 obsahuje dva tetradekamery (Doplňkový obr. 1d). Nebyla pozorována žádná elektronová hustota pro rezidua 1-22 ze všech 28 podjednotek v důsledku krystalového balení (obr. 1c, Doplňkový obr. 1d). Kromě toho β8-pramen (zbytky 130-137; obr. 1a) je viditelný pouze částečně ve všech podjednotkách. ADEP-14 je vázán na NmClpP v podobné konfiguraci jako ADEP-04 (obr. 2e, f a 3e, f). Stručně řečeno, difluorofenylová část ADEP-14 zaujímá hydrofobní kapsu tvořenou Y67, L95, L97 a L119 jedné podjednotky A V49, L53, T84 a F87 sousední podjednotky (obr. 3e). Šestičlenný kruh skupiny kyseliny pipekolové je vystaven rozpouštědlu a je stabilizován fenylovým kruhem F117 a hydrofobními postranními řetězci L97, L119 a L196 (obr. 3e). Dodatečná substituce methyl na Allo-threoninovém zbytku depsipeptidového kruhu (obr. 1b) je vystaven rozpouštědlu. Podobně jako ADEP-04 je ADEP-14 zajištěn ve vysoce komplementární hydrofobní kapse dvěma vodíkovými vazebnými interakcemi mezi fenolickou hydroxylovou skupinou Y67, aminoskupinou zbytku difluorfenylalaninu a alaninovou karbonylovou skupinou v depsipeptidovém kruhu a vodíkovou vazbou zprostředkovanou rozpouštědlem s E56 (obr. 3e, f). Boční řetězec kyseliny oktadienové ADEP-14 je umístěn v úzkém hydrofobním kanálu tvořeném L53, F54 a S57 jedné podjednotky A R27, L28, E31, I33, F35 a Y67 sousední podjednotky (obr. 3e).

vazba ACP1 a ADEP má za následek zřetelné alosterické účinky na hlaveň ClpP

pomocí struktur apo-a sloučenin vázaných forem EcClpP a NmClpP (obr. 1c), zkoumali jsme alosterické účinky, ke kterým dochází při vazbě aktivátoru. Jak je znázorněno na doplňkovém obr. 2, vazba aktivátoru působí jako klín způsobující boční posunutí dvou sousedních podjednotek. Rozsah globální konformační změny způsobené vazbou ACP1-06 (rmsd = 0,84 Å vzhledem k apo-EcClpP) je podobný jako u ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å vzhledem k apo-NmClpP), ale méně než u ADEP-14 (rmsd = 2,47 Å vzhledem k apo-NmClpP). Je zajímavé, že směr posunutí je mezi oběma třídami aktivátorů odlišný (Doplňkový obr. 2 a doplňující Filmy 1-4). Mezi oběma Adepy způsobuje ADEP-14 větší celkovou strukturální poruchu vůči nmclpp válci (srovnejte 3 vs. 4). Adep-vazba má za následek expanzi apikálního povrchu NmClpP doprovázenou zúžením v rovníkové oblasti. Čep pro tento pohyb je v oblasti rukojeti složený ze šroubovice aE a pramene β8. Tento jev je pozorován u všech dosud známých struktur ClpP vázaných na ADEP, s různým stupněm zhutnění válce Clpp15, 18,19,23, 40. Naproti tomu vazba ACP1-06 na EcClpP způsobuje pohyb všech podjednotek směrem dovnitř, což vede k utažení válce ClpP (Doplňkový Film 1). Struktury tedy ukazují, že ACP1s a ADEPs aktivují ClpP vyvoláním odlišných alosterických účinků.

ve strukturách ecclpp a NmClpP vázaných na aktivátor zůstávají elektrostatické vazby mezi prstencem a prstencem, které stabilizují tetradekamer, zachovány i přes konformační změny (Doplňkový obr. 3). Kromě toho, bez ohledu na globální strukturální změnu při vazbě aktivátoru, katalytické triády ser-His-Asp EcClpP a NmClpP udržují katalyticky Kompetentní geometrie, protože v blízkosti aktivního místa dochází pouze k malým posunům páteře Ca (Doplňkový obr. 1a–c). Analýza všech existujících struktur ClpP vázaných na ACP1 a ADEP ukazuje, že vazba sloučenin má také za následek kontrakci rovníkové oblasti (Doplňkový obr. 4).

kvantifikovali jsme zhutnění válce ClpP při vazbě ACP1 nebo ADEP měřením objemů příslušných katalytických komor (Doplňkový obr. 4). Vazba ACP1-06 způsobuje ~5% pokles objemu katalytické Komory vzhledem k apo-EcClpP. Adep1-vazba na EcClpP má za následek podobné snížení objemu katalytické Komory. To je také pozorováno u jiných struktur ClpP vázaných na aktivátor, jako je NmClpP vázaný na ADEP-14, BsClpP vázaný na ADEP a heterooligomerní komplex MtClpP1P2 vázaný na Adep(Doplňkový obr. 4).

aktivace ClpP vede k reorganizaci elektrostatické vazebné sítě v axiálních pórech

ve struktuře apo-NmClpP stabilizují dvě elektrostatické vazby v blízkosti axiálních pórů rozhraní libovolných dvou sousedních podjednotek (obr. 3d, Doplňkový obr. 5). Nejprve záporně nabitá karboxylátová skupina E58 jedné podjednotky tvoří iontový pár s kladně nabitou skupinou R27 guanidinium sousední podjednotky. Za druhé, S57 hydroxylové a E31 karboxylátové skupiny dvou sousedních podjednotek tvoří vodíkovou vazbu. Při vazbě ADEP se tyto dvě nekovalentní vazby zlomí, zatímco iontová vazba mezi R27 a E31 stejné podjednotky se zkrátí, tj. zesílí (obr. 3e, f). V apo-EcClpP pouze jedna iontová vazba mezi E67 a R36 spojuje dvě sousední podjednotky, protože ekvivalentní zbytek S57 NmClpP je alanin v EcClpP a není tedy schopen vytvořit vodíkovou vazbu s E40 (obr. 3a). Stejně jako v NmClpP, vazba ACP1 nebo ADEP1 na EcClpP eliminuje iontovou vazbu mezi jednotkou E67-R36 a vede k silnější iontové vazbě mezi R36 a E40 (obr. 3b, c, Doplňkový obr. 5).

abychom tato pozorování dále ověřili, Navrhli jsme nmclpp a EcClpP bodové mutanty, které vedou ke ztrátě výše uvedených mezibuněčných elektrostatických vazeb. Jak je znázorněno na obr. 4a, zatímco WT NmClpP nebyl schopen degradovat proteinový kasein, bylo zjištěno, že mutant NMCLPP E58A degraduje kasein vyšší rychlostí než mutant E31A. Důležité je, že dvojitý mutant E31A + E58A měl ještě vyšší aktivitu než jednotlivé mutanty. Rozsah aktivace dvojitého mutantu NmClpP je podobný rozsahu pozorovanému v přítomnosti 1 µM ADEPs nebo 10 µM ACP1s (obr. 4a). Podobné chování bylo pozorováno u EcClpP s podobnými mutacemi (E40A a E67A; obr. 4b). Příslušný dvojitý mutant EcClpP není rozpustný a nemohl být testován.

následně jsme stanovili rentgenové struktury mutantů NmClpP E58A a nmclpp E31A + E58A (Tabulka 1). Katalytická místa v obou mutantech nejsou narušena (Doplňkový obr. 1e). V nmclpp e58a single mutant mutace ruší intersubjunitní iontovou vazbu E58-R27 a vede k silnější intrasubjunitní interakci R27-E31, zatímco vodíková vazba mezi S57 a E31 zůstává (obr. 4c). Podobný „klínový efekt“ je tedy pozorován ve struktuře, jak ukazuje jemná globální konformační změna v páteři Ca mutanta nmclpp (rmsd = 0,33 Å vzhledem k WT NmClpP) (Doplňkový Film 5). Mutace jak E31, tak E58 na alanin pro generování dvojitého mutantu NmClpP E31A + E58A (rmsd = 0,29 Å vzhledem k WT NmClpP) ruší dvě stabilizační meziúrovňové elektrostatické interakce, stejně jako iontová vazba intrasubunit R27–E31 přítomná v nmclpp e58a single mutant (obr. 4d a doplňkový Film 6) a v NmClpP vázaném na ADEP (obr. 3e, f). Dvojitý mutant NMCLPP E31A + E58A je tedy na rozdíl od NmClpP vázaného na ADEP s eliminovanou intrasubunitní iontovou vazbou, ale přesto je aktivovaným proteinem s vnitřní proteolytickou aktivitou srovnatelnou s aktivací ClpP aktivovaného malými molekulami (obr. 4a). Stejně jako NmClpP vázaný na ADEP mají jednoduché i dvojité mutanty NmClpP snížené objemy katalytické komory v důsledku zhutnění hlavně ClpP (Doplňkový obr. 4).

taková reorganizace vazebné sítě je pozorována u všech aktivovaných struktur ClpP dostupných v PDB, ať už v přítomnosti aktivátorů s malými molekulami nebo v důsledku specifických mutací (Doplňkový obr. 6). Například aktivátor s malými molekulami, který se váže na B. subtilis ClpP( BsClpP), s.aureus ClpP (SaClpP), m. tuberculosis ClpP (MtClpP) a Homo sapiens ClpP (Hsclpp), ruší jednu nebo dvě intersubunitní elektrostatické vazby poblíž axiálních pórů a vede k silnější, intrasubunitní iontové interakci (Doplňkový obr. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. V MtClpP2 intersubjunitní iontová vazba ekvivalentní interakci E58-R27 v NmClpP neexistuje18. Ekvivalentní zbytek pro E58 NmClpP je L66 v MtClpP2 a není schopen se účastnit iontové interakce s K35 MtClpP2 (ekvivalentní R27 NmClpP). Místo toho intersubjunktní vodíková vazba mezi S65 a E39 stabilizuje rozhraní (Doplňkový obr. 6g, h). Adep vazba na MtClpP2 přerušuje vodíkovou vazbu S65-E39 a posiluje intrasubunitní iontovou vazbu mezi K35 a E3918.

je zajímavé, že i aktivovaná varianta SaClpP Y63A41, s aktivační mutací nalezenou ve středu hydrofobního místa, a proto není ekvivalentní aktivačním mutacím NmClpP zde prezentovaným, podporuje náš navrhovaný model reorganizace vodíkové vazebné sítě kolem axiálního póru po aktivaci ClpP (Doplňkový obr. 6f). Ve struktuře mutantu SaClpP Y63A se zvětšuje vzdálenost mezi dvojicí intersubunitových iontů (Q54-R23), zatímco intrasubunitový solný můstek (R23–D27) je posílen (Doplňkový obr. 6d, f). Také jsme vygenerovali ekvivalentní mutaci Y63A v EcClpP i NmClpP. Mutant NMCLPP Y67A byl nerozpustný, zatímco EcClpP Y76A měl aktivitu mírně vyšší než mutant E40A ,ale nižší než aktivita mutantu E67A (obr. 4b).

aktivace ClpP má za následek snížení strukturní heterogenity n-terminálních axiálních smyček

jak bylo uvedeno výše, v uspořádané axiální smyčce komplexu NmClpP+ADEP-04 tvořící β1–β2 vlásenku se vazba ADEP uvolňuje R27 z intersubjunitní iontové vazby s E58 a posiluje intrasubjunitní iontovou vazbu s E31 šroubovice aA (obr. 5a). V důsledku toho R27 vytváří iontovou vazbu s D23 řetězce β1 axiální smyčky. Tato stabilizační interakce je pozorována ve všech strukturách ClpP vázaných na aktivátor, kde jsou uspořádány axiální smyčky (obr. 5a–e).

pro strukturu EcClpP+ACP1-06 jsou axiální smyčky (zbytky 14-31) částečně uspořádány v krystalu s pouze 1 ze 14 axiálních smyček tvořících β1–β2 vlásenkovou zatáčku (obr. 1C-úplné objednání se zdá být částečně zabráněno efekty krystalového balení). V uspořádané axiální smyčce podjednotky a umožňuje uvolnění R36 z mezibuněčné iontové vazby s E67 vytvoření silnější intrasubunitní iontové vazby s E40 šroubovice aA (obr. 5f). Neexistuje však žádná stabilizační iontová interakce mezi E22 řetězce β1 a R36 šroubovice aA, pravděpodobně kvůli částečnému uspořádání(obr. 5f). Přídavná vodíková vazba mezi D32 řetězce β2 a S21 šroubovice aA ukotvuje axiální smyčku k jádrové doméně EcClpP (obr. 5f). Podobně jsou axiální smyčky ve struktuře Enterococcus faecium ClpP (EfClpP) – ADEP4 objednány pouze částečně 21. Konzervovaná vodíková vazba mezi zbytkem ARG šroubovice aA a záporně nabitým zbytkem řetězce β1 není vidět v částečně uspořádaných axiálních smyčkách EfClpP, ačkoli EfClpP má potenciální vodíkovou vazbu tvořící zbytky na řetězci β1 (T6) a na spojovacích řetězcích smyčky β1 a β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (obr. 5g).

kromě konzervovaných elektrostatických interakcí stabilizují axiální smyčky rozsáhlé hydrofobní kontakty s doménou hlavy ClpP. V EcClpP+ACP1-06 se nepolární n-koncové zbytky řetězce β1 a předchozí strukturované cívky účastní hydrofobních interakcí s nepolárními zbytky šroubovice aA stejné podjednotky a na hydrofobních plochách spirál aA ‚a aB‘ sousední podjednotky (Doplňkový obr. 7a). Nepolární zbytky na spirálách aA, aB‘ a β3′ tvoří spojitou hydrofobní náplast na obvodu axiálního póru (Doplňkový obr. 7b) 15.

pro získání jasnějšího obrazu konformační heterogenity axiálních smyček ClpP byly poté provedeny methyl-TROSY NMR experimenty. Zpočátku byla do axiálních smyček NmClpP(T10C) zavedena jediná cysteinová mutace. Rovnoměrně deuterovaný protein byl vyroben a následně reagoval s 13C-methyl-methanethiosulfonátem (MMTS). To má za následek připojení jedné NMR viditelné skupiny 13CH3-S k cysteinovému postrannímu řetězci, což vede k tvorbě rezidua s-methylthio-cysteinu (MTC) 42. Tato metoda poskytuje snadný způsob sledování struktury a dynamiky velkých komplexů v roztoku. Sledování NMR korelací připojené spinové sondy ve volných, aktivátorově vázaných nebo mutovaných formách enzymu poskytuje odečet konformace roztoku axiálních pórů.

zpočátku byly provedeny kontrolní experimenty, aby se zajistilo, že zavedení t10mtc skupiny nenaruší strukturu NmClpP. Stručně řečeno, 1H-13C heteronukleární multiple quantum coherence (HMQC) korelace WT A T10MTC nmclpp značené 13CH3 na postranním řetězci zbytků ILVM v jinak plně deuterovaném pozadí byly porovnány a bylo zjištěno, že jsou prakticky identické. Následně byly získány 1H-13C HMQC korelace nmclpp T10MTC v různých stavech (obr. 6a). Apo-forma (modré obrysy) má velké množství korelací, což naznačuje strukturálně heterogenní axiální smyčky. Přidání dvojnásobného molárního přebytku ADEP-28 (aktivita uvedená na obr. 4a) přes monomerní ClpP významně snížil počet korelací (červené obrysy), což svědčí o rigidifikaci nebo strukturálním uspořádání. Naproti tomu vazba ACP1-17 (dvojnásobný molární přebytek oproti monomernímu ClpP; aktivita uvedená na obr. 4a) vede k nedetekovatelným změnám pozorovaných korelací (zelené obrysy), což znamená, že axiální smyčky nejsou ovlivněny.

tento přístup byl také využit ke sledování účinku aktivačních mutací (obr. 4a, b) na axiálních smyčkách. V těchto experimentech byly aktivační mutace zavedeny na pozadí mutace t10c (značení). Jak je znázorněno na obr. 6A, korelace mutantu NmClpP T10MTC/E31A (červené obrysy) jsou o něco méně heterogenní než forma pseudo WT, zatímco korelace mutantu NmClpP T10MTC/E58A (oranžové obrysy) jsou prakticky nezměněny. Současná přítomnost obou aktivačních mutací (NmClpP T10MTC / E31A + E58A) má mnohem dramatičtější účinek než jednotlivé mutace a odstraňuje velké množství korelací odpovídajících axiálním smyčkám(černé obrysy). To je v souladu s pozorováním, že dvojitý mutant je aktivnější než jednotlivé mutanty (obr. 4a).

aktivace ClpP vede ke snížení konformační heterogenity oblasti rukojeti

stejný přístup založený na NMR byl použit ke zkoumání účinku vazby aktivátoru a mutací na oblast rukojeti. I144mtc (helix AE) mutant nmclpp byl připraven a studován NMR ve formách vázaných na apo-, ADEP-28-a ACP1-17. Apo-forma (modré obrysy, obr. 6A) vykazuje dvojici vrcholů, což naznačuje, že oblast rukojeti je spojena s dvojicí koexistujících konformací, jak je vidět v naší předchozí práci na EcClpP4. Zajímavé je, že přidání ACP1 a ADEP vede ke zmizení jednoho z vrcholů. Vzhledem k tomu, že vazebné místo aktivátoru je distální od spinové sondy NMR, zdá se, že vazba ACP1 nebo ADEP alostericky vybírá pro jednu z konformací v oblasti rukojeti. Alternativně mohou být aktivátory schopny vázat obě formy, ale vyvolat změnu do jediného stavu.

experimenty s výměnou magnetizace se zpožděním míchání 100, 200, 300, 400, 500, a 600 ms při 40 °C nebylo schopno detekovat žádnou interkonverzi mezi konformery pozorovanými pro oblast rukojeti pro WT NmClpP. To znamená, že proces výměny je příliš pomalý pro charakterizaci NMR.

SAXS demonstruje aktivátorem indukované ClpP konformační změny v roztoku

pro další zkoumání oligomerního stavu a strukturálních změn při vazbě sloučenin byly vzorky apo-NmClpP a NmClpP+ADEP-04 charakterizovány SAXS (obr. 6b-g a doplňkový obr. 8). Konečné sloučené křivky jsou znázorněny na obr. 6b, a získané profily SAXS se podobaly profilům dutých konstrukcí43. Nebyly zjištěny žádné významné změny, pokud jde o celkové skládání (Doplňkový obr. 8), poloměr gyrace (Rg)a oligomerní stav, když byl ADEP-04 přidán k NmClpP (Doplňkový obr. 8c). Aby bylo možné dále analyzovat profily NMCLPP SAXS a generovat struktury ab initio řešení, byl program GNOM použit pro konstrukci párových funkcí distribuce vzdálenosti, p(r). Apo-NmClpP p (r) odhalil jemný pravý posun a větší maximální rozměr (Dmax) ve srovnání s nmclpp vázaným na ADEP-04 (obr. 6c a doplňkový obr. 8c). Následně byly vytvořeny fiktivní atomové modely (přehrady) pomocí dat SAXS pro vizuální analýzu struktur řešení NmClpP (obr. 6d–g). Bylo vygenerováno deset modelů pro nmclpp vázané na apo-NmClpP a Adep-04 a byly vybrány nejpravděpodobnější modely. Tyto modely ukázaly, že celkově jsou dvě struktury řešení NmClpP podobné (duté válce). Při překrytí odpovídajícími krystalovými strukturami však byly snadno pozorovány rozdíly, které souhlasí se strukturami s vysokým rozlišením (obr. 6d, e). Měření axiálních výšek všech deseti přehrad pro nmclpp vázané na apo a ADEP – 04 vedlo k hodnotám 93,0 ± 5,4 Å pro formu apo a 103,5 ± 6,1 Å pro formu vázanou na ADEP-04. Pro další potvrzení tohoto pozorování jsou průměrné pravděpodobnostní mapy přehrad a mapy s nejvyšší obsazeností das (obr. 6F, g) byly analyzovány. Axiální výšky vykazovaly nárůst asi o 10 Å pro NmClpP vázaný na ADEP-04 ve srovnání s apo-NmClpP. Navíc NmClpP vázaný na ADEP-04 vykazoval větší obvod axiálních pórů než apo-NmClpP (obr. 6f, g). Navzdory nízkému rozlišení techniky SAXS tedy výsledky naznačují, že vazba ADEP-04 na NMCLPP neovlivňuje oligomerní stav NmClpP, ale způsobuje expanzi axiálních pórů a zvýšenou obsazenost v horní a spodní části přehrady NmClpP+ADEP-04 (obr. 6e, g) ve srovnání s apo-NmClpP. To pravděpodobně odráží konformační změny vedoucí ke snížené heterogenitě struktury n-terminálních axiálních smyček NmClpP pozorované rentgenem a NMR.