pozadí: chronická lymfocytární leukémie (CLL) má klasický imunofenotyp, který se skládá z omezení světelného řetězce, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – a CD79b-. To ji odlišuje od normálních B buněk a dalších lymfoproliferativních poruch (LPD). Protilátky zaměřené na tyto antigeny jsou zahrnuty do dvou 8barevných panelů průtokové cytometrie vyvinutých konsorciem Euroflow pro zpracování LPD B buněk. Kombinace těchto protilátek do jednoho 10barevného panelu by byla nákladově efektivnější. Kromě toho mohou nové terapie CLL vyvolat hluboké remise, což vytváří rostoucí poptávku po měření minimálního reziduálního onemocnění (MRD), definovaného jako mající více než 1 zbytkovou leukemickou buňku na 10 000 leukocytů (10-4). Současný mezinárodní standardizovaný přístup pro měření MRD zavedený Evropskou výzkumnou iniciativou pro CLL (ERIC) používá panel protilátek zaměřených na CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b a CD81. Tyto kombinace protilátka-fluorochrom se však liší od kombinací používaných diagnostickými panely Euroflow. Laboratoře uvažující o provedení testování MRD by tedy musely zakoupit protilátky pro 3 různé panely (2 diagnostické a 1 MRD). Rozšířili jsme 8barevnou screeningovou zkumavku lymfocytů Euroflow (LST) tak, aby zahrnovala CD200 a CD23, takže CLL může být detekována v jedné 10barevné zkumavce při úrovních až 0.01%. Cílem této studie bylo určit potenciální úspory nákladů při implementaci tohoto nového panelu a zjistit, zda je dostatečně citlivý na detekci MRD.
metody: vypočítali jsme počet vzorků analyzovaných naší modifikovanou 10barevnou lst trubicí (mLST1, získanou lyofilizovanou) od dubna 2018 do března 2019, abychom vyloučili LPD a počet alikvotů protilátek uložených pomocí tohoto přístupu ve srovnání se standardní 2-trubkovou metodou Euroflow. Vytvořili jsme také verzi výše zmíněného panelu (mLST2) s použitím tekutých protilátek ke zvýšení zobecnění našich výsledků, nahrazením CD38 CD43, abychom zjistili, zda se tato zlepšená detekce MRD (viz panely níže). Pro testování MRD jsme použili vzorky CLL od 24 různých pacientů k výrobě 60 vzorků MRD v různých koncentracích leukemických buněk. Vzorky byly připraveny spikováním CLL buněk do suspenzí normálních leukocytů v přibližných koncentracích 0,1%, 0,01% a 0,001%. Každý vzorek byl alikvotován a obarven třemi panely: ERIC, mLST1 a mLST2. Data byla získána pomocí Bd FACSCanto II nebo BD FACSAria Fusion a analyzována pomocí softwaru Bd FACSDiva. CLL buňky byly identifikovány na základě diferenciální exprese klíčových markerů a MRD byl vypočítán jako počet CLL buněk / celkových leukocytů. Pozitivita MRD byla definována jako ≥ 0, 01%. Dohoda mezi panely byla hodnocena metodou bland-Altman plot. Vypočítali jsme také procentuální shodu mezi panely při identifikaci pozitivity MRD.
výsledky: za 1 rok byl mLST1 proveden na 474 vzorcích, z nichž 220 mělo LPD a 123 (56%) mělo klasický CLL fenotyp, čímž se vyloučila potřeba dalšího testování. To vedlo k čisté úspoře 476 alikvotů protilátek. Pro hodnocení MRD byly diferenciální exprese CD5 a CD20 nejvýznamnějšími přispěvateli k odlišení CLL od normálních B buněk pomocí mLST1 a mLST2. Identifikovali jsme jeden případ CLL s atypickým imunofenotypem (dim CD5, bright CD20), který se ukázal jako obtížně brán pomocí panelu mLST. Ve výsledcích MRD, které byly získány s panely mLST a Výborem ERIC, byla shoda. Pro hodnoty nad limit kvantifikace byla 95% hranice dohody ±0,3369 log pro srovnání ERIC vs mLST1 a ±0,3485 log pro srovnání ERIC vs mLST2. Variabilita hladin MRD mezi panely byla tedy po většinu času menší než 2krát, což jsme považovali za klinicky přijatelné, protože MRD se měří v exponenciální stupnici. Výbor ERIC a mLST1 měly 88,3% shodu v rozlišování vzorků pozitivních na MRD a negativních na MRD. Dohoda byla 93,3% mezi porotou ERIC a mlst2.
závěry: použití modifikovaného 10barevného panelu LST pro diagnostiku i MRD měření CLL je proveditelné. Výhodou je zvýšená znalost protilátek a potenciální úspora nákladů, díky čemuž je MRD přístupná více laboratořím cytometrie. Atypické CLL případy bez obvyklé pozitivity CD5 a dim CD20 jsou velmi obtížně brány pomocí panelu LST. V těchto případech je panel ERIC jasně lepší, protože CD22, CD79b, CD81 a CD43 mohou stále poskytovat oddělení mezi maligními a normálními lymfocyty.
Bazinet: BD Biosciences: Other: poskytlo významné množství protilátek použitých v tomto projektu zdarma.. Wever: Teva Canada Innovation: Zaměstnanost. Gimmig: BD Biosciences: zaměstnanost. Johnson: Lundbeck: zaměstnání, Honoraria, členství v představenstvu nebo poradních výborech účetní jednotky, jiné: cestovní poplatky, dary a další, financování výzkumu; Merck: poradenství, Honoraria; Roche: poradenství, zaměstnání, Honoraria, členství v představenstvu nebo poradních výborech účetní jednotky, jiné: cestovní poplatky, dary a další, financování výzkumu; Abbvie: poradenství, zaměstnání, Honoraria, členství v představenstvu nebo poradních výborech účetní jednotky, financování výzkumu; Bd Biosciences: jiné: Poskytl významnou část protilátek použitých v tomto projektu zdarma.; BMS: poradenství, Honoraria; Seattle Genetics: Honoraria.